خبریں

Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے محدود CSS سپورٹ حاصل ہے۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس دوران، مسلسل تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے رینڈر کریں گے۔
کینسر کے خلیوں نے سیلولر تناؤ پر قابو پانے اور ترقی جاری رکھنے کے لیے مختلف میکانزم تیار کیے ہیں۔پروٹین کناز آر (پی کے آر) اور اس کا پروٹین ایکٹیویٹر (پی اے سی ٹی) ابتدائی جواب دہندگان ہیں جو مختلف تناؤ کے اشاروں کی نگرانی کرتے ہیں جو سیل کے پھیلاؤ اور اپوپٹوس کو روکتے ہیں۔تاہم، کینسر کے خلیوں میں PACT-PKR راستے کا ضابطہ بڑی حد تک نامعلوم ہے۔یہاں، ہم نے پایا کہ طویل نان کوڈنگ RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) PACT-PKR راستے کی روک تھام میں براہ راست ملوث ہے اور کینسر کے خلیوں کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے۔CRISPRi 971 کینسر سے وابستہ lncRNA کی بڑے پیمانے پر فنکشنل اسکریننگ کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے پایا کہ DARS-AS1 نمایاں طور پر بڑھے ہوئے کینسر کے خلیوں کے پھیلاؤ سے وابستہ تھا۔لہذا، DARS-AS1 ناک آؤٹ سیل کے پھیلاؤ کو روکتا ہے اور وٹرو میں مختلف کینسر سیل لائنوں میں کینسر سیل اپوپٹوسس کو فروغ دیتا ہے اور Vivo میں ٹیومر کی افزائش کو نمایاں طور پر کم کرتا ہے۔میکانکی طور پر، DARS-AS1 PACT ایکٹیویشن ڈومین سے براہ راست منسلک ہوتا ہے اور PACT-PKR تعامل کو روکتا ہے، اس طرح PKR ایکٹیویشن، eIF2α فاسفوریلیشن، اور اپوپٹوٹک سیل کی موت کو روکتا ہے۔طبی لحاظ سے، DARS-AS1 کا ایک سے زیادہ کینسر میں وسیع پیمانے پر اظہار کیا جاتا ہے، اور اس lncRNA کا زیادہ اظہار خراب تشخیص کا اشارہ ہے۔یہ مطالعہ DARS-AS1 lncRNA کے ذریعہ PACT-PKR راستے کے کینسر سے متعلق مخصوص ضابطے کو واضح کرتا ہے اور کینسر کی تشخیص اور علاج کے لیے ایک اور ہدف فراہم کرتا ہے۔
تناؤ کے مطابق ڈھالنے کی صلاحیت کینسر کے خلیوں کی بقا اور پھیلاؤ کی ایک اہم خصوصیت ہے۔سخت مائیکرو ماحولیات میں کینسر کی چوٹی کا تیزی سے پھیلاؤ اور میٹابولک نشانیاں — غذائی اجزاء کی کمی، ہائپوکسیا، اور کم پی ایچ — جو سیل کی موت کے سگنلنگ راستے کو متحرک کر سکتے ہیں۔تناؤ کے لیے حساس جینز جیسے p535، ہیٹ شاک پروٹین 6، 7، KRAS8، 9، اور HIF-110، 11، 12، 13 کی بے ضابطگی اکثر کینسر میں دیکھی جاتی ہے، اس طرح اپوپٹوسس کو روکتا ہے اور بقا کو فروغ دیتا ہے۔
پروٹین کناز آر (PKR) ایک اہم تناؤ سینسر اور یوکرائیوٹک انیشیشن فیکٹر 2α (eIF2α) کا سبونائٹ کناز ہے، جو ایک مترجم ریگولیٹر ہے جو سیلولر تناؤ کو سیل کی موت سے جوڑتا ہے۔PKR کو اصل میں ایک اینٹی وائرل پروٹین کے طور پر ایک غیر ملکی ڈبل پھنسے ہوئے RNA (dsRNA) کی شناخت کے ذریعے شناخت کیا گیا تھا۔فعال ہونے پر، PKR فاسفوریلیٹس eIF2α وائرل اور سیلولر پروٹین کی ترکیب کو روکنے کے لیے 14,15,16۔PACT (PKR ایکٹیویٹر پروٹین) کی شناخت dsRNA17,18,19,20,21,22,23 کی غیر موجودگی میں پہلے PKR ایکٹیویٹر پروٹین کے طور پر کی گئی ہے۔PKR کے ساتھ براہ راست تعامل کے ذریعے، PACT مختلف تناؤ (سیرم فاقہ کشی، پیرو آکسائیڈ یا آرسینائٹ ٹریٹمنٹ) کو PKR اور نیچے کی طرف اشارہ کرنے والے راستوں میں منتقل کرتا ہے۔eIF2α فاسفوریلیشن کے علاوہ، PACT کی ثالثی PKR ایکٹیویشن تناؤ کے ردعمل سے وابستہ مختلف واقعات کو متحرک کرتی ہے، بشمول PI3K/Akt24 پاتھ وے کے ذریعے تبدیل شدہ ریڈوکس سٹیٹس، p5325,26 کے ذریعے DNA نقصان کی بہتر جانچ اور NF-κB27,28 ٹرانسکرپشن کو منظم کرتا ہے۔ تناؤ کے ردعمل، پھیلاؤ، اپوپٹوسس اور دیگر اہم سیلولر عمل میں ان کے اہم کردار کو دیکھتے ہوئے، PKR اور PACT بہت سی بیماریوں، خاص طور پر کینسر30,31,32,33 کے علاج کے اہداف کا وعدہ کر رہے ہیں۔تاہم، اس pleiotropic فنکشنل اور حیاتیاتی اہمیت کے باوجود، کینسر کے خلیوں میں PACT/PKR کی سرگرمی کا ضابطہ مضمر ہے۔
lncRNAs 200 نیوکلیوٹائڈس سے بڑی نقلیں ہیں جن میں پروٹین کوڈنگ کی کوئی صلاحیت نہیں ہے۔چونکہ جدید ترین جینوم کی ترتیب کے منصوبوں نے ہزاروں lncRNAs کی نشاندہی کی ہے، ان کے حیاتیاتی افعال کو واضح کرنے کے لیے کافی کوشش کی گئی ہے۔تحقیق کے بڑھتے ہوئے جسم نے یہ ظاہر کیا ہے کہ lncRNAs بہت سے حیاتیاتی عملوں میں ملوث ہیں 37 بشمول X-chromosome inactivation 38,39, imprinting40, transscription41,42, translation43 اور حتیٰ کہ کینسر کی نشوونما44,45,46,47۔ان مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ بہت سے lncRNAs PACT/PKR راستے میں شامل ہیں۔ایسی ہی ایک تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ lncRNA ASPACT نے PACT نقل کو روکا اور PACT mRNA کی جوہری برقراری میں اضافہ کیا۔دیگر مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ lncRNA nc886 PKR سے منسلک ہوتا ہے اور اس کے فاسفوریلیشن 49,50 کو روکتا ہے۔ابھی تک، lncRNA کو منظم کرنے والے PACT کی ثالثی PKR ایکٹیویشن کی اطلاع نہیں ملی ہے۔
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) کی شناخت ایک oncogenic lncRNA51,52,53,54 کے طور پر کی گئی ہے۔miP-194-5p53، miP-12952 اور miP-532-3p51 کے ریگولیشن کے ذریعے، DARS-AS1 کو بالترتیب کلیئر سیل رینل سیل کارسنوما، تھائیرائیڈ کارسنوما اور نان سمال سیل پھیپھڑوں کے کارسنوما کی افزائش کو فروغ دینے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ٹونگ اور ساتھیوں نے یہ بھی پایا کہ DARS-AS1 پروٹین 39 (RBM39) RNA- پابند شکل کے استحکام کو برقرار رکھتے ہوئے مائیلوما کی ترقی کو فروغ دیتا ہے۔تاہم، اس بارے میں کوئی مطالعہ نہیں کیا گیا کہ آیا یہ lncRNA PACT-PKR ایکٹیویشن کے ضابطے اور کینسر کے خلیوں کے تناؤ کے ردعمل میں شامل ہے۔
یہاں، ہم نے CRISPRi سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے ایک بڑے پیمانے پر نقصان کے فنکشن اسکرین کا مظاہرہ کیا اور یہ طے کیا کہ DARS-AS1 lncRNA کئی قسم کے کینسر کے خلیوں کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے۔اس کے علاوہ، ہم نے ایک بڑے میکانزم کی نشاندہی کی ہے: DARS-AS1 براہ راست PACT سے منسلک ہوتا ہے، PACT اور PKR بائنڈنگ کو روکتا ہے، eIF2α کے فاسفوریلیشن کو روکتا ہے، ایک کم PKR سبسٹریٹ، اور بالآخر اپوپٹوٹک سیل کی موت کو روکتا ہے۔آخر میں، ہمارا کام DARS-AS1 lncRNA کو PACT-PKR پاتھ وے کے ریگولیٹر اور کینسر کے علاج اور تشخیص کے لیے ایک ممکنہ ہدف کے طور پر ظاہر کرتا ہے۔
جینومک پروفائلنگ کے وسیع مطالعے نے کینسر سے وابستہ سینکڑوں lncRNAs کی نشاندہی کی ہے۔تاہم، ان کا کام زیادہ تر نامعلوم ہے56۔کینسر کے بڑھنے میں ملوث lncRNA امیدواروں کی نشاندہی کرنے کے لیے، ہم نے CRISPRi نظام (تصویر 1a) کا استعمال کرتے ہوئے SW620 کولوریکٹل کینسر سیل لائن میں پھیلاؤ کو کم کرنے کے لیے ایک نقصان کی اسکرین کا مظاہرہ کیا۔SW480 اور SW620 بڑی آنت کے کینسر سیل لائنوں کی انوکھی خصوصیت یہ ہے کہ وہ ایک ہی مریض میں پرائمری اور سیکنڈری ٹیومر سے اخذ ہوتے ہیں۔یہ اعلی درجے کی بڑی آنت کے کینسر کی ترقی میں جینیاتی تبدیلیوں کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک قابل قدر موازنہ فراہم کرتا ہے۔لہذا، ہم نے آر این اے کی ترتیب کا استعمال کرتے ہوئے کولوریکٹل کینسر سیل لائنوں (SW480 اور SW620) کے ٹرانسکرپٹومز کا تجزیہ کیا اور شائع شدہ لٹریچر سے کچھ ممکنہ فنکشنل lncRNAs اکٹھا کیا۔ان نتائج کی بنیاد پر، ہم نے ایک پولڈ sgRNA لائبریری ڈیزائن کی جس میں 7355 sgRNA oligos کو نشانہ بنایا گیا جس میں 971 کینسر سے وابستہ lncRNAs اور 500 غیر ہدف شدہ sgRNA oligos کو منفی کنٹرول کے لیے بنایا گیا تھا (ضمنی ڈیٹا 1)۔
CRISPRi سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے اسکریننگ کی منصوبہ بندی کی نمائندگی۔ب اسکریننگ کے بعد ایس جی آر این اے کی افزودگی۔افقی نقطے والی لکیر لاگ 2 (فولڈ چینج) = ±0.58 کی نمائندگی کرتی ہے۔عمودی نقطے والی لائن p قدر = 0.05 کی نشاندہی کرتی ہے۔سیاہ نقطے غیر ہدف والے sgRNA (NC کے طور پر نامزد) کی نمائندگی کرتے ہیں۔سرخ نقطے DARS-AS1 کو نشانہ بنانے والے sgRNAs ہیں۔نیلے نقطے LINC00205 کو نشانہ بنانے والے sgRNAs ہیں، جو پہلے بیان کردہ oncogenic lncRNA ہے۔فولڈ چینج = (نارملائزڈ ریڈنگ، دن 17)/(نارملائزڈ ریڈنگ، دن 0)۔c DARS-AS1 sgRNA ناک ڈاؤن سیل کی نشوونما کو روکتا ہے۔ایرر بارز تین تجربات کے ± معیاری انحراف کی نمائندگی کرتے ہیں۔* p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01 دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ۔ٹیومر میں DARS-AS1 اظہار (TCGA ڈیٹاسیٹ)۔DARS-AS1 کا اظہار بالترتیب BLCA، KIRC، PRAD، LUSC، UCEC، LUAD، LIHC، KIRP، اور COAD والے مریضوں سے جوڑی والے نارمل اور ٹیومر کے نمونوں میں (TCGA ڈیٹاسیٹ)۔پی-ویلیوز جوڑی والے دو دم والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے تھے۔
پلازمیڈ کی تعمیر اور لینٹی وائرس کی پیکیجنگ کے بعد، ہم نے dCas9-SW620 کولوریکٹل کینسر سیل لائن کو مندرجہ بالا لائبریری کے ساتھ انفیکشن کے چار آزاد تجربات میں منتقل کیا۔ان انفیکشنز کے لیے انفیکشن کی کثرت (MOI) 0.1–0.3 تھی، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ ہر سیل کو صرف ایک sgRNA سے منتقل کیا جا سکتا ہے۔وٹرو کلچر کے 18 دنوں کے بعد، اسکریننگ کے بعد ہدف sgRNAs کی افزودگی پروفائل میں کمی یا اضافہ ہوا، جبکہ غیر ٹارگٹڈ کنٹرول oligonucleotides کی تعداد پری اسکریننگ پروفائل کے مقابلے میں نسبتاً کوئی تبدیلی نہیں رہی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ہمارا ہدف ایک انتہائی مخصوص اسکریننگ کا حامل ہے۔ کتب خانہ.چاول۔1b اور ضمنی جدول 1)۔ LINC00205، جو پہلے پھیپھڑوں کے کینسر اور جگر کے کینسر کے بڑھنے کے بارے میں بتایا گیا تھا 58,59,60، اس اسکریننگ کی وشوسنییتا کی تصدیق کرتے ہوئے (لوگ 2 (فولڈ چینج) < −0.58، p قدر <0.05) کی جانچ کی گئی۔ LINC00205، جو پہلے پھیپھڑوں کے کینسر اور جگر کے کینسر کے بڑھنے کے بارے میں بتایا گیا تھا 58,59,60، اس اسکریننگ کی وشوسنییتا کی تصدیق کرتے ہوئے (لوگ 2 (فولڈ چینج) < −0.58، p قدر <0.05) کی جانچ کی گئی۔ LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1ب)۔ LINC00205، جو پہلے پھیپھڑوں کے کینسر اور جگر کے کینسر کی ترقی کو فروغ دینے کے لیے رپورٹ کیا گیا تھا58,59,60، کو خارج کر دیا گیا تھا (log2 (fold change) <-0.58، p-value <0.05)، اس اسکریننگ کی مضبوطی کی تصدیق کرتا ہے (تصویر .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 肝癌 肝癌 肝癌 进展 58،59،60 ， 被 选 选 掉 （（（Log2 （变化） <-0.58 ， P 值 <0.05） ， ， 该 筛选 筛选 的 可靠性 1b） Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 肝癌 肝癌 肝癌 进展 58،59،60 ， 被 选 选 掉 （（（Log2 （变化） <-0.58 ， P 值 <0.05） ， ， 该 筛选 筛选 的 可靠性 1b） LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1ب)۔ LINC00205، جو پہلے پھیپھڑوں اور جگر کے کینسر کی ترقی کو فروغ دینے کے لیے رپورٹ کیا گیا تھا 58,59,60، کو خارج کر دیا گیا تھا (log2 (fold change) <-0.58، p-value <0.05)، اس اسکریننگ کی مضبوطی کی تصدیق کرتا ہے (تصویر .1b)۔
ٹیسٹ کیے گئے تمام lncRNAs میں سے، DARS-AS1 کی بھی اسکریننگ کی گئی، جس میں 18 دن کی ثقافت کے بعد تین کوگنیٹ sgRNA oligonucleotides نمایاں طور پر کم ہو گئے، یہ تجویز کرتا ہے کہ اس lncRNA کے ناک آؤٹ ہونے کے نتیجے میں کینسر کے پھیلاؤ میں کمی واقع ہوئی (تصویر 1b)۔اس نتیجہ کو کولوریکٹل کینسر کے خلیوں میں ایم ٹی ایس کے تجزیے سے مزید مدد ملی جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ DARS-AS1 دستک ڈاؤن خلیوں کی شرح نمو صرف کنٹرول سیلز (شکل 1c) کے مقابلے میں آدھی رہ گئی تھی اور کینسر کی کئی دیگر اقسام کی پچھلی رپورٹس کے مطابق تھی۔: واضح سیل گردے کا کینسر، تھائیرائیڈ کینسر اور غیر چھوٹے سیل پھیپھڑوں کا کینسر51,52,53,55۔تاہم، کولوریکٹل کینسر میں اس کا فنکشن اور مالیکیولر میکانزم ابھی تک دریافت نہیں ہوا ہے۔لہذا، ہم نے مزید مطالعہ کے لیے اس lncRNA کا انتخاب کیا۔
مریضوں میں DARS-AS1 اظہار کا مطالعہ کرنے کے لیے، ہم نے کینسر جینوم اٹلس (TCGA) پروجیکٹ سے 10,327 ٹیومر کے نمونوں کا جامع تجزیہ کیا۔ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 مختلف قسم کے ٹیومر میں صحت مند خلیوں میں وسیع پیمانے پر ظاہر ہوتا ہے اور نمایاں طور پر اپ گریڈ ہوتا ہے، بشمول کولون اڈینو کارسینووما (COAD)، رینل کلیئر سیل کارسنوما (KIRC)، اور رینل پیپلیری سیل کارسنوما (KIRP)۔.بہت کم (تصویر 1d اور ضمنی شکل 1a، b)۔ جوڑا بنائے گئے صحت مند/ٹیومر کے نمونوں کے تجزیے نے مثانے کے یوروتھیلیل کارسنوما (BLCA)، گردے کے رینل کلیئر سیل کارسنوما (KIRC)، پروسٹیٹ اڈینو کارسینوما (PRAD)، پھیپھڑوں کے اسکواومس سیل کارسنوما (LUSC) کے ٹیومر میں DARS-AS1 کے نمایاں طور پر زیادہ اظہار کی تصدیق کی۔ , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC)، پھیپھڑوں کے اڈینو کارسنوما (LUAD)، جگر کے ہیپاٹو سیلولر کارسنوما (LIHC)، گردے کے رینل پیپلیری سیل کارسنوما (KIRP)، اور بڑی آنت کے اڈینو کارسینوما (COAD) (p قدر <0.05) (تصویر 1e) . جوڑا بنائے گئے صحت مند/ٹیومر کے نمونوں کے تجزیے نے مثانے کے یوروتھیلیل کارسنوما (BLCA)، گردے کے رینل کلیئر سیل کارسنوما (KIRC)، پروسٹیٹ اڈینو کارسینوما (PRAD)، پھیپھڑوں کے اسکواومس سیل کارسنوما (LUSC) کے ٹیومر میں DARS-AS1 کے نمایاں طور پر زیادہ اظہار کی تصدیق کی۔ , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC)، پھیپھڑوں کے اڈینو کارسنوما (LUAD)، جگر کے ہیپاٹو سیلولر کارسنوما (LIHC)، گردے کے رینل پیپلیری سیل کارسنوما (KIRP)، اور بڑی آنت کے اڈینو کارسینوما (COAD) (p قدر <0.05) (تصویر 1e) .جوڑے کے صحت مند/ٹیومر کے نمونوں کے تجزیے نے بھی مثانے کے یوروتھیلیل کارسنوما (BLCA)، کلیئر سیل رینل اور رینل سیل کارسنوما (KIRC)، پروسٹیٹ اڈینو کارسینوما (PRAD)، پھیپھڑوں کے اسکواومس سیل کارسنوما (LUSC) ٹیومر میں DARS-AS1 کے نمایاں طور پر زیادہ اظہار کی تصدیق کی۔, карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) ، کارپس uteri (UCEC) کا اینڈومیٹریال کارسنوما، پھیپھڑوں کا اڈینو کارسنوما (LUAD)، جگر کا ہیپاٹو سیلولر کارسنوما (LIHC)، گردے کا پیپلیری سیل کارسنوما (KIRP)، اور بڑی آنت کا اڈینو کارسنوما (COAD) (p قدر < 0.05) (تصویر 1e-m)۔配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 Dars-AS1 在 膀胱 尿路 尿路 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 透明 透明 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 肺鳞状 肺鳞状 肺鳞状 细胞癌 细胞癌 细胞癌 的 的 肿瘤 肿瘤 肿瘤 中 中 中 中 中 中 中 中 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌显着 更 表达 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （UCEC） 肺腺癌 肺腺癌 （（Luad） ， 肝肝 细胞癌 细胞癌 （lihc） ， 肾 乳头状 细胞癌 （（（（（（（（（和结肠腺癌 和结肠腺癌 （（（（（（（P 值<0.05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 了 了 皮癌 、 、 肾 上 上 皮癌 、 肾 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 、 、 细胞癌 细胞癌.癌 （کرپ） （کوڈ）（p 值<0.05））（图1e-m） .صحت مند/ٹیومر کے جوڑے والے نمونوں کے تجزیے نے مثانے کے یوروتھیلیل کارسنوما (BLCA)، کلیئر سیل رینل سیل کارسنوما (KIRC)، پروسٹیٹ اڈینو کارسینوما (PRAD)، اور پھیپھڑوں کے اسکواومس سیل کارسنوما (LUSC) ٹیومر میں DARS-AS1 کے کردار کی مزید تائید کی۔экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m)۔ کارپس یوٹیرن کارسنوما (UCEC)، پھیپھڑوں کے اڈینو کارسنوما (LUAD)، hepatocellular carcinoma (LIHC)، رینل پیپلیری سیل کارسنوما (KIRP)، اور بڑی آنت کے اڈینو کارسنوما (COAD) (p قدر <0.05) (شکل 1e -m) میں اظہار۔ایک ساتھ لے کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ DARS-AS1 مختلف قسم کے کینسروں میں وسیع پیمانے پر اور بہت زیادہ ظاہر ہوتا ہے۔
چونکہ DARS-AS1 اور DARS (اینٹی سینس اسٹرینڈ کو انکوڈنگ کرنے والا جین) ایک ہی پروموٹر کا اشتراک کرتے ہیں اور ایک دوسرے کے قریب واقع ہیں، ہم نے shRNA کو خاص طور پر DARS-AS1 کو ناک کرنے کے لیے ڈیزائن کیا ہے لیکن DARS نہیں (ضمنی شکل 2a،b اور ضمنی جدول 2) .SW620 کے علاوہ، ہم نے shRNA دستک ڈاؤن (ضمنی جدول 3) کی افادیت اور کام کا مطالعہ کرنے کے لیے DARS-AS1 کا اظہار کرنے والی تین دیگر سیل لائنوں کا بھی استعمال کیا۔ہمارے نتائج نے اشارہ کیا کہ تیار کردہ تینوں shRNAs نے DARS mRNA (ضمنی شکل 2c–f) کی مقدار پر بہت کم اثر کے ساتھ کم از کم 80% DARS-AS1 ناک ڈاؤن کارکردگی حاصل کی ہے۔اس کے علاوہ، ہم نے پایا کہ ان shRNAs کے ساتھ DARS-AS1 دستک ڈاؤن نے کولیٹریکٹل کینسر سیل لائنوں SW620 (49.7%) اور HCT116 (27.7%)، بریسٹ کینسر سیل لائن MBA-MD-231 (53.4%) میں سیل کی نشوونما کو نمایاں طور پر روک دیا۔) اور HepG2 ہیپاٹوما سیل لائن (92.7% کمی)، نیز ان کی بے ترتیب دائرے بنانے کی صلاحیت (اوسط کمی ~50.8%، 44.6%، 40.7% اور 75.7% فی سیل لائن) (تصویر 2a،b)۔SW620 میں، کالونی کی تشکیل پرکھ کے نتائج نے مزید تصدیق کی کہ DARS-AS1 shRNA نے تقریباً 69.6٪ کی اوسط کمی کے ساتھ سیل کے پھیلاؤ کو نمایاں طور پر روکا (تصویر 2c)۔
SW620، HCT116، MBA-MD-231، اور HepG2 خلیوں میں سیل کے پھیلاؤ (a) اور اسفیرائڈ کی تشکیل (b) پر کنٹرول shRNA اور DARS-AS1 shRNA کا اثر۔c SW620 خلیوں میں کالونی کی تشکیل پر کنٹرول shRNA اور DARS-AS1 shRNA کا اثر۔سیل پھیلاؤ (d)، اسفیرائڈ کی تشکیل (e)، اور SW620 خلیوں کی کالونی کی تشکیل (f) جو DARS-AS1 کو زیادہ متاثر کرتی ہے۔دکھایا گیا ڈیٹا تین تجربات کا اوسط ± معیاری انحراف ہے۔* p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01، اور *** p ≤ 0.001 بذریعہ دو دم والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ۔
فنکشن کے نقصان کے مطالعے کو پورا کرنے کے لیے، ہم نے اس کے بعد SW620 سیلز بنائے جو DARS-AS1 (ضمنی شکل 2g) سے زیادہ متاثر ہوتے ہیں۔DARS-AS1 اوور ایکسپریشن نے SW620 خلیات (تصویر 2d–f) میں سیل کی نشوونما (1.8 گنا)، غیر اینکرڈ اسفیرائڈ کی تشکیل (1.4 گنا) اور کالونی کی تشکیل (3.3 گنا) میں نمایاں اضافہ کیا۔ہم نے ایک اور DARS-AS1 ایکسپریسنگ سیل لائن، A549 کا استعمال کرتے ہوئے اس نتیجے کی تصدیق کی۔DARS-AS1 اوور ایکسپریشن کی وجہ سے سیل کے اس بڑھے ہوئے پھیلاؤ کو مزید A549 خلیات میں دیکھا گیا (ضمنی شکل 2h، i اور ضمنی جدول 3)۔ایک ساتھ لے کر، یہ فائدہ اور نقصان کے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 وٹرو میں کینسر کے خلیوں کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے۔
بنیادی طریقہ کار کو دریافت کرنے کے لیے جس کے ذریعے DARS-AS1 سیل کے پھیلاؤ کو منظم کرتا ہے، ہم نے اس کے ممکنہ پروٹین بائنڈنگ شراکت داروں کی شناخت کے لیے RNA پل ڈاؤن تجزیہ کیا۔RT-qPCR کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 کا تقریباً 86.2% SW620 خلیات کے سائٹوپلازم میں واقع ہے (ضمنی شکل 3a)۔ان وٹرو میں نقل شدہ بایوٹینیلیٹڈ DARS-AS1 یا pseudoRNA کو پھر SW620 سیل لائسیٹس کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا جس کے بعد SDS-PAGE علیحدگی ہوئی۔بعد میں چاندی کے داغوں سے ظاہر ہوا کہ DARS-AS1 پل کے نمونوں میں ایک الگ بینڈ (~38 kDa) نمایاں طور پر افزودہ تھا لیکن ڈمی RNA یا موتیوں کے نمونوں میں نہیں (تصویر 3a)۔اس بینڈ کی شناخت PKR ایکٹیوٹنگ پروٹین (PACT) کے طور پر ماس اسپیکٹومیٹری (MS) کے ذریعے کی گئی تھی اور SW620، HCT116، اور HepG2 سیل لائنز (تصویر 3a،b) میں امیونوبلوٹنگ کے ذریعے مزید تصدیق کی گئی تھی۔DARS اور متعلقہ PACT پروٹین - PKR اور TRBP - کی افزودگی کی بھی مغربی بلاٹنگ (WB) کے ذریعہ RNA تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے چھان بین کی گئی۔نتائج نے اشارہ کیا کہ DARS-AS1 RNA اور ان تینوں پروٹینوں کے درمیان کوئی براہ راست تعامل نہیں پایا گیا (ضمیمہ تصویر 3b)۔DARS-AS1 اور PACT کے درمیان مخصوص تعامل کی مزید تصدیق RNA immunoprecipitation (RIP) تجزیہ سے ہوئی، جس سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 اینٹی PACT اینٹی باڈیز میں نمایاں طور پر افزودہ تھا لیکن دوسرے کنٹرول RNAs (شکل 3c) میں نہیں۔اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا DARS-AS1 کسی دوسرے سیلولر اجزاء کی عدم موجودگی میں پی اے سی ٹی کے ساتھ براہ راست تعامل کرتا ہے، پیوریفائیڈ پی اے سی ٹی کا استعمال کرتے ہوئے ان وٹرو بائیولیئر انٹرفیومیٹری (BLI) پرکھ کی گئی۔بایوٹین کے لیبل والے DARS-AS1 یا ڈمی RNA کو اسٹریپٹاویڈن (SA) بائیوسینسرز پر متحرک کیا گیا تھا اور پھر 1 μM PACT پر مشتمل کائنےٹک بفر میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔خاص طور پر، PACT مضبوطی سے DARS-AS1 (KD ویلیو ~ 26.9 nM) کا پابند ہے، لیکن RNA (شکل 3d) کی نقل کرنے کے لیے نہیں۔ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج DARS-AS1 اور PACT کے درمیان براہ راست تعامل اور اعلی تعلق کو ظاہر کرتے ہیں۔
RNA پل تجزیہ نے شناخت کیا کہ DARS-AS1 SW620 خلیوں میں PACT کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔اوپر، متعلقہ پروٹین کے چاندی کے داغ۔نچلے امیونو بلوٹس کو اینٹی پی اے سی ٹی اینٹی باڈی کے ساتھ انجام دیا گیا تھا۔b RNA پل ڈاؤن تجزیہ HCT116 (اوپر) اور HepG2 (نیچے) خلیوں میں کیا گیا تھا۔پی اے سی ٹی کی افزودگی کا پتہ امیونوبلوٹنگ کے ذریعہ لگایا گیا تھا۔اشارہ شدہ اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے SW620 خلیوں میں cRNA امیونوپریسیپیٹیشن (RIP) اسیس انجام دیے گئے تھے۔d PACT بائنڈنگ منحنی خطوط مکمل لمبائی DARS-AS1 یا کنٹرول RNA کو بائیولیئر انٹرفیومیٹری (BLI) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا گیا تھا۔آر این اے کو اسٹریپٹاویڈن بائیو سینسر پر متحرک کیا گیا تھا۔1 μM PACT ایسوسی ایشن کی پیمائش کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔e RNA پل پرکھ بایوٹینیلیٹڈ فل لینتھ DARS-AS1 یا کٹے ہوئے (اوپر) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔امیونو بلوٹ دکھا رہا ہے PACT موصول ہوا (نیچے)۔f پیوریفائیڈ فلیگڈ پی اے سی ٹی کو بایوٹینیلیٹڈ فل لینتھ DARS-AS1 کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا یا ان وٹرو RIP پرکھ کے لیے (جیسا کہ e میں) چھوٹا کیا گیا تھا۔نکالے گئے RNA کی تصدیق RT-qPCR سے ہوئی۔جی پی اے سی ٹی کے لیے مختلف آر این اے کے ٹکڑوں کی نسبتی وابستگی بائیولیئر انٹرفیومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی گئی تھی۔تجزیہ کے لئے، 100 nM RNA اور 1 μM RAST استعمال کیا گیا تھا۔h ان وٹرو آر آئی پی اسسیس پیوریفائیڈ انٹیکٹ یا کٹے ہوئے لیبل والے PACT کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیے گئے تھے۔نکالے گئے RNA کی تصدیق RT-qPCR سے ہوئی۔i SW620 خلیات کی شرح نمو جو کہ DARS-AS1، PACT، یا دونوں سے زیادہ ظاہر کرتی ہے۔j SW620 خلیوں میں مکمل لمبائی یا کٹے ہوئے DARS-AS1 کے اوور ایکسپریشن کے سیل کی نشوونما پر مختلف اثرات مرتب ہوئے۔k اپوپٹوس کا پتہ اینٹی PARP اینٹی باڈی کے ساتھ امیونو بلوٹنگ کے ذریعے کیا گیا تھا۔l DARS-AS1 کا ناک آؤٹ SW620 خلیوں کے apoptosis کی حوصلہ افزائی کرتا ہے جیسا کہ فلو سائٹومیٹری کے ذریعہ دکھایا گیا ہے۔دکھایا گیا ڈیٹا تین تجربات کا اوسط ± معیاری انحراف ہے۔ *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001، دو دم والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کے ذریعے۔ *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001، دو دم والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کے ذریعے۔ *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001 بذریعہ دو دم والے طالب علم کے ٹی-ٹیسٹ۔ *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001، 通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001، 通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001 بذریعہ دو دم والے طالب علم کے ٹی-ٹیسٹ۔
اس کے بعد ہم نے PACT ایسوسی ایشن (شکل 3e) کے لیے درکار DARS-AS1 خطے کی شناخت کے لیے وٹرو ٹرانسکرپشن کے ذریعے تین بایوٹینیلیٹڈ DARS-AS1 RNA کے ٹکڑے بنائے۔RNA تجزیہ کے نتائج سے ظاہر ہوا کہ ہر ایک ٹکڑا PACT کے ساتھ تعامل کرنے کے قابل تھا، لیکن 3′-ٹرمینل ریجن (384–768 نیوکلیوٹائڈز جن پر A3 کا لیبل لگا ہوا ہے) نے A1 لیبل والے 1–384 نیوکلیوٹائڈز سے زیادہ دکھایا (تصویر 3e)۔اسی طرح کے نتائج ان وٹرو RIP پرکھ میں ریکومبیننٹ PACT (شکل 3f) کا استعمال کرتے ہوئے دیکھے گئے۔ان نتائج سے مطابقت رکھتے ہوئے، BLI کا استعمال کرتے ہوئے PACT سے متحرک RNA کے ٹکڑوں کو باندھنے کے تجربات نے یہ بھی ظاہر کیا کہ PACT کا A3 (384–768 nt) (KD ویلیو تقریباً 94.6 nM) سے زیادہ تعلق ہے، جبکہ دیگر علاقوں سے تقریباً کوئی تعلق نہیں ہے۔(تصویر 3 ڈی)۔
ہم نے PACT میں منسلک بائنڈنگ علاقوں کا بھی جائزہ لیا۔پی اے سی ٹی میں تین فنکشنل ڈومینز ہیں، جن میں سے دو محفوظ شدہ ڈبل سٹرینڈڈ آر این اے بائنڈنگ ڈومینز (dsRBD) اور تیسرا ڈومین (نامزد D3) ہیں جو پروٹین کے تعاملات کو متحرک کرنے والے کے طور پر کام کرتے ہیں۔ہر ایک ڈومین کی lncRNA بائنڈنگ صلاحیت کی جانچ کرنے کے لیے، ہم نے تین ایسے تغیرات کو انجنیئر کیا جس نے تینوں ڈومینز میں سے ہر ایک کو ہٹا دیا اور ان وٹرو RIP پرکھ کا مظاہرہ کیا۔ہمارے نتائج نے ظاہر کیا کہ PACT کے تیسرے ڈومین (D3) کو حذف کرنے سے دیگر دو تغیرات (تصویر 3h) کے مقابلے DARS-AS1 (برقرار PACT کے مقابلے میں 0.11 گنا) کے ساتھ اس کے تعامل کو نمایاں طور پر کم کیا گیا، یہ دکھایا گیا کہ ریلیز D3 کے DARS کے ساتھ بات چیت کی۔-AC1۔ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ DARS-AS1 اور PACT کے درمیان تعامل بنیادی طور پر DARS-AS1 کے 3′ اختتام اور PACT کے D3 ڈومین کے ذریعے ہو سکتا ہے۔
ہم نے نوٹ کیا کہ DARS-AS1 کا PACT اظہار پر کوئی اثر نہیں ہوا اور PACT کا DARS-AS1 (ضمنی شکل 3c) پر کوئی اثر نہیں ہوا۔اس کے بعد ہم نے سیل کی نمو پر PACT دستک ڈاؤن کے اثر کا جائزہ لیا۔DARS-AS1 کے برعکس، PACT کو دستک دینے پر رشتہ دار خلیات 1.5–3 گنا تیزی سے بڑھے (ضمنی شکل 3d)۔کالونی تشکیل پرکھ کے نتائج نے اشارہ کیا کہ خلیات نے پی اے سی ٹی (ضمیمہ تصویر 3e) کے ساتھ shRNA علاج کے بعد 2-3 گنا کالونیاں بنائی ہیں۔یہ جانچنے کے لیے کہ آیا DARS-AS1 PACT کے ذریعے سیل کے پھیلاؤ کو کنٹرول کرتا ہے، ہم نے PACT، DARS-AS1، یا دونوں کو اوور ایکسپریس کرنے والے SW620 سیلز بنائے۔پی اے سی ٹی کے اوور ایکسپریشن نے سیل کے پھیلاؤ کو نمایاں طور پر روکا (شکل 3i)۔جب کہ DARS-AS1 اوور ایکسپریشن فی se نمایاں طور پر سیل کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے، DARS-AS1 اور PACT سے زیادہ اظہار کرنے والے خلیوں کی شرح نمو میں کوئی خاص فرق نہیں تھا۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ PACT DARS-AS1 اوور ایکسپریشن کی وجہ سے بڑھتے ہوئے پھیلاؤ کا مقابلہ کر سکتا ہے۔
چونکہ DARS-AS1 کے مختلف خطوں میں مختلف PACT پابند کرنے کی صلاحیتیں ہیں، ہم نے DARS-AS1 کے ٹکڑوں کے مختلف اوور ایکسپریشن کے ذریعے سیل کے پھیلاؤ پر ان کے رشتہ دار اثر کی چھان بین کی۔دوسرے دو ٹکڑوں کے مقابلے میں، DARS-AS1 3′ آخر (384–768 nt) پر زیادہ متاثر ہوا، DARS-AS1 میں PACT سے متعلق اہم خطہ، جس میں خلیات کے پھیلاؤ کو تحریک دینے کی اعلیٰ صلاحیت تھی (تصویر 3j)۔یہ نتائج بائنڈنگ صلاحیت اور DARS-AS1 کے حیاتیاتی فعل کے درمیان مثبت ارتباط کی نشاندہی کرتے ہیں۔
پی اے سی ٹی کو ایک پرو اپوپٹوٹک پروٹین 19 بتایا گیا ہے۔لہذا، ہم نے apoptosis پر DARS-AS1 کے اثر کی تحقیقات کی۔جیسا کہ توقع کی گئی ہے، DARS-AS1 دستک ڈاؤن نے SW620 خلیوں میں PARP کلیویج کو نمایاں طور پر بڑھایا اور SW620، HCT116، HepG2، اور MBA-MD-231 سیل لائنوں (تصویر 3k) میں اینیکسن V-مثبت خلیوں کے تناسب میں اضافہ کیا۔3)۔3f–h) سے ظاہر ہوتا ہے کہ کینسر کے خلیوں میں DARS-AS1 کا اینٹی اپوپٹوٹک اثر PACT کے apoptosis-inducing فنکشن کے برعکس ہے۔ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ DARS-AS1 oncogenic فنکشن کا طریقہ کار PACT فنکشن کی روک تھام کے ذریعے ہو سکتا ہے۔
اگلا، ہم نے DARS-AS1-PACT ایسوسی ایشن کے عملی مضمرات کو دریافت کیا۔PACT کو براہ راست تعامل کے ذریعے PKR کو چالو کرنے کی اطلاع دی گئی ہے، جو بعد میں eIF2α فاسفوریلیشن کو بڑھاتا ہے، جس سے ترجمے کے حذف ہونے اور apoptosis17 کا سبب بنتا ہے۔پہلے، ہم نے جانچ کی کہ آیا DARS-AS1 PACT اور PKR کے سیلولر لوکلائزیشن کو متاثر کرتا ہے۔Confocal fluorescence microscopy سے پتہ چلتا ہے کہ PACT اور PKR SW620 خلیات میں 0.72 کے اوسط پیئرسن ارتباط کے گتانک کے ساتھ انتہائی اجتماعی تھے۔دریں اثنا، DARS-AS1 اوور ایکسپریشن نے PACT اور PKR کو-لوکلائزیشن کو نمایاں طور پر کم کر دیا (مطلب پیئرسن کوریلیشن گتانک 0.61) (شکل 4a)۔اس بات کی جانچ کرنے کے لیے کہ آیا DARS-AS1 PACT-PKR تعامل کو ماڈیول کر سکتا ہے، ہم نے SW620 سیل لائسیٹس میں اینٹی PACT اینٹی باڈی کے ساتھ کو-امیونوپریسیپیٹیشن (کو-آئی پی) پرکھ کی۔PKR کو کنٹرول سیلز میں اینٹی PACT میں بہت زیادہ افزودہ کیا گیا تھا، جبکہ PKR ریکوری DARS-AS1 (تصویر 4b) سے زیادہ ظاہر کرنے والے خلیوں سے لائسیٹس میں نمایاں طور پر کم ہوئی تھی۔پیوریفائیڈ لیبل والے پی اے سی ٹی اور پی کے آر کو وٹرو پروٹین بائنڈنگ اسیس کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔اس کے مطابق، وہ لوگ جنہوں نے DARS-AS1 فراہم کیا لیکن کوئی کنٹرول نہیں RNA نے دبایا ہوا PACT-PKR تعامل دکھایا (شکل 4c)۔تمام نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 نے PACT اور PKR مواصلات میں خلل ڈالا۔
کنفوکل فلوروسینس مائیکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے کنٹرول سیلز یا DARS-AS1 کو زیادہ متاثر کرنے والے خلیوں میں PACT اور PKR کی مشترکہ لوکلائزیشن کا مشاہدہ کیا گیا۔نیوکلی DAPI سے داغے ہوئے تھے۔شماریاتی نتائج 16 تصاویر سے حاصل کیے گئے۔b Co-Immunoprecipitation (co-IP) کنٹرول SW620 سیلز یا DARS-AS1 کو اوور ایکسپریس کرنے والے سیلز کے سیل لائسیٹس میں اینٹی PACT اینٹی باڈی کا استعمال۔c کا لیبل لگا ہوا PACT، پیوریفائیڈ PKR اور DARS-AS1 کے ساتھ وٹرو میں نقل کیا گیا یا موک RNA کو وٹرو پروٹین بائنڈنگ تجزیہ کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔اینٹی فلیگ اینٹی باڈیز امیونوپریسیپیٹیشن کے لیے استعمال کی گئیں۔d اشارہ شدہ اینٹی باڈیز کے ساتھ امیونو بلوٹس SW620 اور HCT116 خلیوں میں انجام دیئے گئے جن کو کنٹرول shRNA یا DARS-AS1-shRNA سے منتقل کیا گیا جس کے بعد سیرم بھوک لگی۔e DARS-AS1 اظہار کی سطحوں نے تھپسیگارگین کے لیے سیلولر حساسیت کو تبدیل کر دیا۔SW620 خلیوں کو DARS-AS1 shRNA، DARS-AS1 اوور ایکسپریشن پلازمیڈ یا کنٹرول پلازمیڈ سے تبدیل کیا گیا تھا۔خلیوں کا علاج 48 گھنٹے تک تھپسیگارگین کے ساتھ کیا گیا اور ایم ٹی ایس ریجنٹ کا استعمال کرتے ہوئے سیل کی قابل عملیت کا تعین کیا گیا۔f ان وٹرو میں نقل شدہ DARS-AS1 یا ڈمی RNA اور پیوریفائیڈ PACT کو وٹرو ایکٹیویشن پرکھ اور امیونو بلاٹ کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔g ان اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے امیونو بلوٹس SW620-ctrl سیلز (بائیں) یا PKR اتپریورتیوں (دائیں) کو اوور ایکسپریس کرنے والے خلیوں پر انجام دیئے گئے تھے۔ان خلیوں کو پھر کنٹرول shRNA یا DARS-AS1-shRNA سے تبدیل کیا گیا جس کے بعد سیرم بھوک لگی۔h فلو سائٹومیٹری نے ظاہر کیا کہ اتپریورتی PKR کے غیر فعال ہونے سے SW620 خلیوں میں DARS-AS1-حوصلہ افزائی apoptosis کی تلافی ہوئی۔i اشارہ شدہ اینٹی باڈیز کے ساتھ امیونو بلوٹس SW620 (بائیں) یا HCT116 (دائیں) خلیوں میں کئے گئے تھے۔کنٹرول shRNA یا DARS-AS1 shRNA سے منتقلی شدہ خلیے سیرم سے محروم ہیں اور 100 nM PKR C16 inhibitor یا DMSO کے ساتھ اضافی ہیں۔اسکیل بار = 5 µm۔دکھایا گیا ڈیٹا تین تجربات کا اوسط ± معیاری انحراف ہے۔* p ≤ 0.05 دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ۔
عام طور پر یہ خیال کیا جاتا ہے کہ ایک بار PACT PKR17 کے ساتھ تعامل کرتا ہے، Thr451 پر PKR فاسفوریلیشن کی حوصلہ افزائی کی جا سکتی ہے۔ہمارے نتائج نے اشارہ کیا کہ سیرم فاقہ کشی کے بعد DARS-AS1 دستک ڈاؤن خلیوں میں PKR فاسفوریلیشن کی سطح نمایاں طور پر بلند ہوئی تھی (تصویر 4d اور ضمنی شکل 4a)۔اسی مناسبت سے، ہم نے پایا کہ eIF2α کی فاسفوریلیشن، مرکزی PKR سبسٹریٹ، میں بھی DARS-AS1 shRNA (تصویر 4d اور ضمنی شکل 4a) کے ذریعے نمایاں اضافہ ہوا ہے۔تھاپسیگارگین ایک ER تناؤ ہے جس کی وجہ سے ER Ca2+ جاری کرتا ہے۔تھپسیگارگین کے ساتھ علاج PACT کے اظہار اور ایکٹیویشن کو دلانے کے لیے بتایا گیا ہے، جو PKR کے ساتھ مزید تعامل کرتا ہے اور اسے چالو کرتا ہے، جس کی وجہ سے eIF2α فاسفوریلیشن 18,61 میں اضافہ ہو کر اپوپٹوسس ہوتا ہے۔یہاں، ہم نے پی اے سی ٹی/ پی کے آر پاتھ وے کے محرک کے طور پر تھپسیگارگین کا استعمال کیا تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا DARS-AS1 خلیات کو PACT/PKR راستے کو روک کر تناؤ پر قابو پانے میں مدد کر سکتا ہے۔ہم نے مشاہدہ کیا کہ DARS-AS1 اظہار کی سطح مثبت طور پر تھپسیگارگین کے خلاف سیل مزاحمت کے ساتھ منسلک ہے۔DARS-AS1 سے زیادہ اثر کرنے والے SW620 خلیے تھپسیگارگین کے ساتھ علاج کرنے پر بہتر طور پر زندہ رہے، جبکہ DARS-AS1 ناک ڈاؤن والے خلیات زیادہ حساس ہو گئے (تصویر 4e)۔ان نتائج سے مطابقت رکھتے ہوئے، DARS-AS1 اوور ایکسپریشن نے تھپسیگارگین-حوصلہ افزائی PKR فاسفوریلیشن کو کم کیا (ضمیمہ تصویر 4b)۔اس کے برعکس، تھاپسیگارگین کے علاج کے بعد، PKR اور eIF2α کو کنٹرول سیلز کے مقابلے DARS-AS1 ناک ڈاؤن سیلز میں زیادہ فاسفوریلیٹ کیا گیا تھا (ضمیمہ تصویر 4b)۔دلچسپ بات یہ ہے کہ تھپسیگارگین نے خوراک پر منحصر انداز میں DARS-AS1 اظہار کی حوصلہ افزائی کی، جو DARS-AS1 (ضمیمہ انجیر 4c) کے اینٹی اسٹریس فنکشن کی نشاندہی کر سکتا ہے۔اس کے علاوہ، ہم نے ان مشاہدات کی تصدیق کے لیے وٹرو ایکٹیویشن اسسیس میں کارکردگی کا مظاہرہ کیا۔مختصراً، PKR کو اینٹی PKR اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے سیل لائسیٹس سے پاک کیا گیا، پھر وٹرو میں نقل شدہ ریکومبیننٹ PACT اور DARS-AS1 کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔انزیمیٹک ردعمل کے بعد، WB کا استعمال کرتے ہوئے فاسفو-PKR کا پتہ چلا۔ہمارے نتائج نے اشارہ کیا کہ PKR فاسفوریلیشن کو DARS-AS1 کے ذریعہ نمایاں طور پر روکا گیا تھا ، لیکن کنٹرول RNA (شکل 4f) کے ذریعہ نہیں۔یہ وٹرو میں اور vivo میں نتائج بتاتے ہیں کہ DARS-AS1 PACT کی ثالثی PKR ایکٹیویشن کو روکتا ہے۔ایک ہی وقت میں، ہم نے DARS-AS1 (شکل 4f) کی موجودگی میں PACT کی بحالی میں کمی کا بھی مشاہدہ کیا۔یہ نتیجہ ان وٹرو پروٹین بائنڈنگ پرکھ (شکل 4c) کے نتائج سے مطابقت رکھتا ہے اور PACT-PKR ایسوسی ایشن کے لیے DARS-AS1 کے بلاکنگ فنکشن کو دوبارہ واضح کرتا ہے۔
PACT کے D3 ڈومین میں Ser246 اور Ser287 سیلولر تناؤ کے تحت PKR ایکٹیویشن کے لیے درکار ہیں۔الانائن کے لیے دو سیرین کی باقیات کے متبادل نے اتپریورتی PACT (mutD) دیا، جس نے تناؤ کی غیر موجودگی میں PKR کو چالو کیا، اور الانائن (mutA) کے متبادل نے پروٹوکول کو الٹ دیا۔چونکہ ہم نے اس ڈومین کی اہمیت کو DARS-AS1 کے ساتھ براہ راست وابستگی میں ظاہر کیا ہے، اس لیے ہم نے یہ دونوں PACT اتپریورتیوں کو یہ جانچنے کے لیے تیار کیا کہ آیا یہ باقیات بھی DARS-AS1 کے ساتھ تعامل میں شامل ہو سکتے ہیں۔دلچسپ بات یہ ہے کہ دونوں اتپریورتیوں نے DARS-AS1 (ضمنی شکل 4d) سے منسلک ہونے کی صلاحیت کھو دی، یہ تجویز کرتا ہے کہ DARS-AS1 کے ساتھ موثر تعامل کے لیے PACT پروٹین کی مکمل ساخت کی ضرورت ہو سکتی ہے۔
مزید برآں، ہمارے نتائج یہ بھی تجویز کرتے ہیں کہ DARS-AS1-shRNA کی حوصلہ افزائی سے سیل کے پھیلاؤ کی روک تھام کو ایک غالب منفی PACT mutant (PACTmutA) یا غالب منفی PKR mutant (PKRmut) (ضمنی شکل 4e. e) سے زیادہ متاثر کر کے جزوی طور پر بحال کیا جا سکتا ہے۔غالب-منفی PKR اتپریورتیوں کے زیادہ اظہار نے PKR فاسفوریلیشن کو کم کیا جو DARS-AS1 دستک ڈاؤن کے ساتھ ساتھ سیرم سے محروم خلیات میں eIF2α فاسفوریلیشن (تصویر 4 جی) کی وجہ سے ہوا ہے۔زیادہ اہم بات یہ ہے کہ DARS-AS1 دستک ڈاؤن کے ذریعے پیدا ہونے والے apoptotic خلیوں کا تناسب PKRmut (تصویر 4h اور ضمنی شکل 4g) سے زیادہ ظاہر کرنے والے خلیوں میں بھی کم ہو گیا تھا۔PKR kinase سرگرمی کی روک تھام DARS-AS1 فنکشن کو بھی متاثر کرتی ہے، جیسا کہ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 ناک ڈاؤن نے شاذ و نادر ہی PKR اور eIF2α فاسفوریلیشن کو متحرک کیا جب خلیوں کا علاج PKR-مخصوص C16 انحیبیٹر (تصویر 4i اور ضمنی شکل 4) سے کیا گیا تھا۔)۔ایک ساتھ مل کر، ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ DARS-AS1 سیل کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے، کم از کم جزوی طور پر، PACT کی ثالثی PKR ایکٹیویشن کو روک کر۔
ٹیومرجینیسیس میں DARS-AS1 کے کردار کو مزید دریافت کرنے کے لئے، ہم نے ماؤس زینوگرافٹ ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے ویوو تجربات میں کارکردگی کا مظاہرہ کیا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 کے دستک ڈاؤن نے چوہوں میں ٹیومر کی نشوونما میں ڈرامائی طور پر کمی کی ہے (p قدر <0.0001) (تصویر 5a)۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 کے دستک ڈاؤن نے چوہوں میں ٹیومر کی نشوونما میں ڈرامائی طور پر کمی کی ہے (p قدر <0.0001) (تصویر 5a)۔ Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 دستک ڈاؤن چوہوں میں ٹیومر کی نشوونما کو تیزی سے کم کرتا ہے (p قدر <0.0001) (شکل 5a)۔结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值<0.0001）（图5a）۔结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）۔ Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 دستک ڈاؤن نے چوہوں میں ٹیومر کی نشوونما کو نمایاں طور پر کم کیا (p قدر <0.0001) (شکل 5a)۔اس طرح، DARS-AS1 ناک آؤٹ گروپ میں، اوسط ٹیومر کے حجم میں تقریباً 72.9٪ اور ٹیومر کے بڑے پیمانے پر تقریباً 87.8٪ (شکل 5b-d) کی نمایاں کمی واقع ہوئی۔یہ نتائج سختی سے تجویز کرتے ہیں کہ DARS-AS1 Vivo میں ٹیومر کی نشوونما کو نمایاں طور پر فروغ دے سکتا ہے۔
عریاں چوہوں میں کولوریکٹل آنکوجینیسیس پر اشتہار DARS-AS1 دستک ڈاؤن کے اثرات۔نمو کے منحنی خطوط (a)، ٹیومر کا سائز (b)، وزن (c)، اور ٹیومر کی تصاویر (d) دکھائی گئی ہیں۔خرابی کی سلاخیں ± SEM کی نمائندگی کرتی ہیں۔ n = 10۔ ****p <0.0001، دو دم والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کے ذریعے۔ n = 10۔ ****p <0.0001، دو دم والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کے ذریعے۔ n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10۔ ****p < 0.0001 دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ۔n = 10۔ ****p <0.0001، 通过双尾学生t 检验. ****p <0.0001، 通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ۔e Kaplan-Meier نے UVM، KICH، KIRP، MESO، GBM، اور LGG کے مریضوں میں DARS-AS1 اظہار کی سطح اور مجموعی طور پر بقا کے درمیان ارتباط کا تجزیہ کیا۔مریضوں میں DARS-AS1 اظہار کی اعلی سطح 50% میں تھی؛مریضوں میں DARS-AS1 اظہار کی کم سطح 50٪ میں تھی۔p-values ​​کا تعین لاگ رینک ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا تھا۔f مجوزہ ماڈل جس میں DARS-AS1 PACT-PKR راستے اور ٹیومر کی نشوونما کو منظم کرتا ہے۔
DARS-AS1 کے طبی اثرات کو بہتر طور پر سمجھنے کے لیے، ہم نے اس کے اظہار اور مریض کی بقا کے درمیان تعلق کا جائزہ لیا۔TCGA ڈیٹاسیٹ کا تجزیہ کرتے ہوئے، ہم نے پایا کہ اعلی DARS-AS1 اظہار یوویل میلانوما (UVM)، رینل کرومو فوبیا (KICH)، رینل پیپلیری سیل کارسنوما (KIRP)، mesothelioma (MESO)، ملٹی پلیکس سے وابستہ تھا۔کم بقا نمایاں طور پر گلیوبلاسٹوما مورفوسس (GBM) اور کم درجے کے دماغی گلیوما (LGG) (شکل 5e) والے مریضوں سے وابستہ تھی۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ DARS-AS1 کلینیکل ٹیومر کی ترقی میں اہم کردار ادا کر سکتا ہے اور ایک سے زیادہ کینسروں میں ممکنہ پیش گوئی کرنے والا بائیو مارکر ہو سکتا ہے۔
اس مطالعہ میں، بڑے پیمانے پر CRISPRi فنکشنل اسکریننگ کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے طے کیا کہ DARS-AS1 lncRNA دو اہم تناؤ کے جواب دہندگان PACT اور PKR کو ریگولیٹ کر کے کینسر کے خلیات کے تناؤ پر قابو پاتا ہے۔PACT کے ساتھ براہ راست بات چیت کرتے ہوئے، DARS-AS1 نے PACT کی ثالثی PKR ایکٹیویشن کو روکا، اس طرح apoptotic سیل کی موت کو روکا اور سیل کے پھیلاؤ کو فروغ دیا (تصویر 5f)۔DARS-AS1 کی اپ گریجولیشن متعدد اقسام کے کینسر میں دیکھی گئی ہے، جس سے معلوم ہوتا ہے کہ دباؤ والے حالات میں کینسر کے خلیوں کی بقا کو فروغ دینے کا اس کا کام متعدد قسم کے کینسر پر وسیع پیمانے پر لاگو ہو سکتا ہے۔
PACT کی شناخت PKR ایکٹیویٹر پروٹین کے طور پر کی گئی ہے، اور PACT کی ثالثی PKR ایکٹیویشن ٹرانسکرپشن، ٹرانسلیشن، اپوپٹوسس، اور دیگر اہم سیلولر پراسیسز کو ریگولیٹ کرکے تناؤ کے ردعمل میں اہم کردار ادا کرتی ہے۔کئی دہائیوں سے، PACT-PKR جھرن کے کینسر سے متعلق مخصوص ضابطے کو سمجھنے کی کوششیں کی جا رہی ہیں۔یہاں، ہمارے مطالعے نے سیلولر lncRNA DARS-AS1 کے ذریعے کینسر کے خلیات میں PACT-PKR کے ریگولیشن کے ایک مختلف طریقہ کار کا انکشاف کیا، جو براہ راست PACT سے منسلک ہوتا ہے، PACT-PKR کے تعامل کو روکتا ہے، PKR ایکٹیویشن اور eIF2α فاسفوریلیشن کو روکتا ہے، اس طرح تناؤ سے متاثرہ aposis اور apoosis کو روکتا ہے۔ حتمی کینسر کے پھیلاؤ کو متحرک کرنا۔خلیاتیہ دریافت کینسر کی تشخیص اور علاج کے لیے ممکنہ lncRNA اہداف پر روشنی ڈالتی ہے۔
ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 دستک ڈاؤن فاسفوریلیٹڈ PKR اور eIF2α میں نمایاں اضافے کے ساتھ خلیوں کو سیرم فاقہ کشی کے لیے حساس بناتا ہے۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ DARS-AS1 PACT/PKR سرگرمی کو روک کر سخت حالات میں کینسر کے خلیوں کی بقا کو فروغ دیتا ہے۔کئی دیگر نان کوڈنگ RNAs، جیسے ASPACT اور nc886، PACT48 mRNA کو کم کرکے یا PKR49,50,64 کا پابند کرکے آٹو فاسفوریلیشن کو ریگولیٹ کرکے PACT/PKR محور میں شامل ہیں۔ان میں سے، DARS-AS1 PACT-PKR ایسوسی ایشن میں خلل ڈالنے والے کے طور پر کام کرتا ہے۔یہ مطالعہ PACT/PKR ایکسس ریگولیشن اور تناؤ کے ردعمل میں lncRNAs کے کردار کے بارے میں ہماری سمجھ کو بہتر بناتا ہے۔
PACT تین الگ الگ ڈومینز پر مشتمل ہے۔پہلے دو dsRBDs میں سے ہر ایک PACT کے PKR سے اعلی تعلق کو حاصل کرنے کے لیے کافی ہے، جبکہ تیسرا ڈومین (D3) وٹرو اور ویوو میں PKR ایکٹیویشن کے لیے درکار ہے۔ہمارے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 ترجیحی طور پر D3 ڈومین (تصویر 3h) کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔lncRNA (768 نیوکلیوٹائڈس) کے بڑے سائز کو دیکھتے ہوئے، DARS-AS1 D3 کا پابند ہونا جسمانی طور پر dsRBD اور PKR کے PACT ڈومین کے درمیان تعامل کو روک سکتا ہے، اس طرح PACT اور PKR کی ایسوسی ایشن کو روک سکتا ہے۔PACT پوائنٹ کے تغیرات جنہوں نے D3 میں Ser246 اور Ser287 کو الانائن یا اسپارٹیٹ سے تبدیل کیا، DARS-AS1 کے لیے اس کی پابند وابستگی میں خلل ڈالا، جو کہ D3 کی مجموعی ساختی اور برقی خصوصیات کی اہمیت کی طرف اشارہ کرتا ہے۔اس میکانزم کی مزید تفصیلات مستقبل میں درکار ہوں گی، زیادہ درست بایو کیمیکل تجزیہ اور اعلی ریزولیوشن PACT ساختی تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے۔
پچھلے مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ DARS-AS1 کئی میکانزم کے ذریعے سیل کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے51,52,53۔ایک مثال میں، تفتیش کاروں نے مشاہدہ کیا کہ DARS-AS1 نے گردے کے کینسر کے خلیوں میں miP-194-5p کو نشانہ بنا کر اپنے اینٹی سینس پروٹین-انکوڈنگ DARS جین کو اپ گریڈ کیا۔تاہم، موجودہ مطالعہ میں، DARS-AS1 دستک ڈاؤن کا متعدد قسم کے کینسر میں DARS ٹرانسکرپشن پر بہت کم اثر پڑا، بشمول کم از کم کولوریکٹل، چھاتی اور جگر کے کینسر۔چونکہ lncRNAs سیل اور بافتوں سے متعلق مخصوص اظہار کے نمونوں کی نمائش کرتے ہیں، اس لیے فنکشنل میکانزم کو کینسر کی اقسام میں محفوظ نہیں کیا جا سکتا ہے، جو ہمارے مشاہدات اور مختلف کینسروں کے پچھلے جائزوں کے درمیان اس تفاوت میں معاون ثابت ہو سکتا ہے۔مختلف جسمانی اور پیتھولوجیکل عمل کے مخصوص میکانزم کو واضح کرنے کے لیے خصوصی مطالعات کی ضرورت ہے۔
طبی اعداد و شمار کے تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ ٹیومر میں DARS-AS1 کا اظہار کینسر کے مریضوں کی بقا کے ساتھ الٹا تعلق رکھتا ہے، جو کینسر کی تشخیص میں DARS-AS1/PACT/PKR محور کی اہمیت کو واضح کرتا ہے۔آخر میں، ہمارے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ DARS-AS1 PACT/PKR سگنلنگ محور کا ایک ریگولیٹر ہے، کینسر کے خلیوں کے پھیلاؤ کو فروغ دیتا ہے، اور تناؤ کے ردعمل کے دوران اپوپٹوسس کو روکتا ہے، جو تحقیق کی ایک اور لائن فراہم کرتا ہے اور ممکنہ علاج میں مستقبل کی تحقیق کے لیے دلچسپی رکھتا ہے۔ .
ہیومن سیل لائنز SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 اور HEK293T چین میں نیشنل سیل لائن ریسورس انفراسٹرکچر سے حاصل کی گئیں۔تمام خلیات کو DMEM میڈیم (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) میں 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) اور 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) کے ساتھ 37 °C، 5% CO2 میں برقرار رکھا گیا تھا۔انکیوبیٹر
اینٹی پی اے سی ٹی، ابکم (ab31967)؛اینٹی پی کے آر، ابکم (ab184257)؛اینٹی PKR (phospho-T451)، Abcam (ab81303)؛اینٹی فلیگ، ابکم (ab125243)؛اینٹی eIF2α، Abcam (A0764))؛اینٹی eIF2α (فاسفورس S51)، Abcam (ab32157)؛مخالف PACT (فاسفورس S246)، Abgent (AP7744b)؛اینٹی β-ٹبلن، CST (2128)؛عام ماؤس IgG، CST (5415S)؛عام خرگوش IgG، CST (2729S)۔اینٹی باڈیز کو ویسٹرن بلوٹنگ کے لیے پی بی ایس ٹی میں 1:1000 اور آئی پی کے لیے 1:100 میں پتلا کیا گیا تھا۔
sgRNAs کو عوامی طور پر دستیاب ٹول کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا جسے CRISPR-ERA66 کہتے ہیں۔ہم نے sgRNA ڈویلپمنٹ کے لیے پہلے سے طے شدہ ٹول پیرامیٹرز کا استعمال کیا اور 3 kb خطے میں الگورتھم کمپیوٹڈ sgRNA بائنڈنگ سائٹس۔TSS میں مرکز۔sgRNA oligonucleotides کے پول CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) میں ترکیب کیے گئے اور انسانی pgRNA پلاسمیڈ (Addgene #44248) میں کلون کیے گئے۔مجموعی طور پر 12 µg پولڈ ہیومنائزڈ pgRNA پلاسمڈ، 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260)، اور 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) کو 5 x 106 HEK106 HEK293cm کے ڈس انفیکشن میں منتقل کیا گیا۔ سیلز (CWBIO، بیجنگ، چین) کارخانہ دار کی ہدایات پر عمل کرتے ہیں۔وائرس پر مشتمل سپرنٹینٹس کو منتقلی کے 48 اور 72 گھنٹے بعد جمع کیا گیا اور 0.45 µm فلٹر کے ذریعے فلٹر کیا گیا۔اسکریننگ کے لیے، dCas9/KRAB فیوژن پروٹین کا اظہار کرنے والے SW620 خلیات وائرس کی منتقلی کے ذریعے حاصل کیے گئے تھے۔ترمیم شدہ SW620 خلیات 0.1-0.3 کے MOI پر چار آزاد انفیکشن تجربات میں وائرس لائبریری سے متاثر ہوئے اور 2 دن کے لیے 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) کے ساتھ نمونے لیے گئے۔اس کے بعد، اسکریننگ کے لیے 500 سیلز/sgRNA کی کم از کم لائبریری کوریج کے ساتھ وٹرو میں 18 دنوں کے لیے سیلز کو کلچر کیا گیا۔
جینومک ڈی این اے QIAamp DNA بلڈ Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183) کی ہدایات کے مطابق نکالا گیا تھا۔مجموعی طور پر، لائبریری کی تعمیر کے لیے 100 μg جینومک ڈی این اے فی حیاتیاتی تکرار استعمال کیا گیا تھا۔ایس جی آر این اے کے علاقے کو پی سی آر کے دو راؤنڈز کے ذریعے بڑھا دیا گیا تھا اور اسے بارکوڈ سے منسلک کیا گیا تھا۔
PCR مصنوعات کو NucleoSpin® جیل اور PCR پیوریفیکیشن کٹ (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) کا استعمال کرتے ہوئے پاک کیا گیا اور Qubit™ HS ڈبل پھنسے ہوئے DNA ڈیٹیکشن کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک؛ Q32854) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی۔
ایم ٹی ایس پرکھ سیل کے پھیلاؤ کی پیمائش کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔خلیوں کو 2000 خلیوں / کنویں کی ابتدائی کثافت پر 96 کنویں پلیٹوں میں سیڈ کیا گیا تھا۔خلیوں کی نسبتہ تعداد روزانہ بتائے گئے وقت پر کل 4-6 دنوں کے لیے ماپا جاتا تھا۔ہر کنویں کے لیے، 20 μl MTS ریجنٹ (Promega) کو 100 μl DMEM کے ساتھ پتلا کیا گیا، 37 ° C پر 4 گھنٹے کے لیے خلیوں کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا، اور پھر OD490 کی پیمائش کی گئی۔
کرہوں کی تشکیل کا تجزیہ کر کے بے ترتیب نمو کی صلاحیت دریافت کی گئی۔مختصراً، shRNA DARS-AS1 یا کنٹرول shRNA سے تبدیل شدہ 2000 خلیات کو ہر 4 دن میں درمیانی تبدیلی کے ساتھ الٹرا لو اٹیچمنٹ مائیکرو پلیٹس (کارننگ) میں کلچر کیا گیا تھا۔اسفیرائڈز کی گنتی 14 دن کے بعد کی گئی۔DARS-AS1 اوور ایکسپریشن پلازمیڈ یا کنٹرول پلاسمڈ کے ساتھ منتقلی کے 500 خلیات کو بڑھانے کے پرکھ کے لئے استعمال کیا گیا تھا، بصورت دیگر طریقہ کوئی تبدیلی نہیں کی گئی تھی۔
RNA کو T7 RNA پولیمریز اور biotin-16-UTP (Roche 1138908910) کا استعمال کرتے ہوئے Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) کی ہدایات کے مطابق نقل کیا گیا تھا۔یہاں استعمال ہونے والے پرائمر ضمنی جدول 4 میں درج ہیں۔
پروٹین کوڈنگ PACT یا PKR علاقوں کو pET15b (Addgene #73619) میں کلون کیا گیا اور BL21 (DE3) میں تبدیل کیا گیا۔بیکٹیریا کو راتوں رات ایمپسلن کے ساتھ فراہم کردہ ایل بی میں انکیوبیٹ کیا گیا اور پھر تازہ ایل بی کے ساتھ 100 گنا گھٹایا گیا۔جب میڈیم کا OD600 0.8 تک پہنچ گیا، تو پروٹین کے اظہار کو دلانے کے لیے 1 mM IPTG شامل کیا گیا۔ہلکی ہلکی ہلکی ہلکی ہلکی ہلکی رات کے ساتھ (20 ° C پر 250 rpm) کے بعد، سیل گولی کو سینٹرفیوگریشن (4000 rpm، 10 منٹ، 4 ° C) کے ذریعے جمع کیا گیا۔سیل گولی کو لیسز بفر (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) میں دوبارہ لگائیں اور برف پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں، پھر سونیکیٹ (15 منٹ، 5 s آن/آف، برف پر) اور سینٹری فیوج (13,000) آر پی ایم)۔، 30 منٹ، 4°С)۔اس کے بعد سپرنٹنٹ کو 4 ° C پر 3 بار Ni-NTA رال (QIAGEN) پر لوڈ کیا گیا، 4 بار واش بفر (50 mM Tris، pH 8.0، 40 mM imidazole، 250 mM NaCl) کے ساتھ دھویا گیا اور مجموعی طور پر 3 بار ایلوٹ کیا گیا۔ 10 ملی لیٹر ایلیونٹ بفر (50 ایم ایم ٹریس، پی ایچ 8.0، 250 ایم ایم NaCl، 300 ایم ایم امیڈازول)۔پیوریفائیڈ پروٹین کا تعین ڈبلیو بی کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور ارتکاز کا تعین Qubit™ پروٹین پرکھ کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک؛ Q 33212) کے ذریعے کیا گیا تھا۔
آر آئی پی اسیسز کو ترمیم کے ساتھ انجام دیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔مختصراً، 1x RIP بفر (25 mM Tris-HCl، pH 7.5، 100 mM NaCl، 0.5% NP-40، RNasin ribonuclease inhibitor (Promega)، PMSF (Beyotime Biotechnology)، 1 mM DDM، پروٹیز 1000000000000 میٹر ڈی ڈی ایم (Roche, 1 mM DTT) اور 13,000 rpm پر 4 °C پر 15 منٹ کے لیے سینٹری فیوج۔اس کے بعد سپرنٹنٹ کو پروٹین A+G مقناطیسی موتیوں (ملی پور) کے ساتھ 5 μg اینٹی PACT اینٹی باڈی (Abeam) یا IgG (CST) کے ساتھ ملایا گیا تھا۔موتیوں کو 5x RIP بفر کے ساتھ 5 بار دھویا گیا، پھر پروٹینیز K (NEB) سے ہضم کیا گیا۔RNA کو Trizol کے ساتھ نکالا گیا تھا اور RT-qPCR کے ذریعہ اس کا تعین کیا گیا تھا۔پرائمر کو ضمنی جدول 5 میں پیش کیا گیا ہے۔
ان وٹرو RIP پرکھ ایک ترمیم شدہ معیاری RIP پرکھ پروٹوکول کے مطابق انجام دیا گیا تھا۔ان وٹرو ٹرانسکرائب شدہ RNA کے کل 5 pmol کو RIP بفر کے ساتھ 1x پتلا کیا گیا اور 65 ° C پر 5 منٹ تک انکیوبیشن کے ذریعے اینیل کیا گیا جس کے بعد کمرے کے درجہ حرارت پر آہستہ ٹھنڈک ہوئی۔مجموعی طور پر 5 pmol برقرار یا تبدیل شدہ پرچم کے لیبل والے PACT پروٹین کو E. coli سے پاک کیا گیا تھا۔4 ڈگری سینٹی گریڈ پر 2 گھنٹے رینیچرڈ آر این اے کے ساتھ انکیوبیٹ کریں اور اینٹی فلیگ آئی پی کے لیے RIP تجزیہ کے لیے مندرجہ بالا طریقہ کار پر عمل کریں۔
آر این اے ایکسٹینشن تجزیہ کے لیے، 1xRIP بفر کے ساتھ 1×107 سیلز کیے گئے تھے۔4°C پر 15 منٹ کے لیے 13,000 rpm پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، سپرنٹنٹ کو 30 μl اسٹریپٹاویڈن میگنیٹک بیڈز (بیک مین) کے ساتھ 4°C پر 2 گھنٹے کے لیے پہلے سے علاج کیا گیا۔اس کے بعد پیوریفائیڈ لائسیٹ کو خمیر کے ٹی آر این اے کے ساتھ فراہم کیا گیا اور اسے راتوں رات 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر 40 پی ایم او ایل رینیچرڈ آر این اے کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا، پھر مزید 2 گھنٹے اور BSA کے ساتھ بلاک شدہ 20 μl نئے اسٹریپٹاویڈن مقناطیسی موتیوں کو شامل کیا گیا۔دھونے کا مرحلہ 5x RIP بفر کے ساتھ 4 بار اور 1x RIP بفر کے ساتھ 4 بار پر مشتمل تھا۔متعلقہ پروٹینوں کو بایوٹین ایلیوشن بفر (25 ملی میٹر Tris-HCl، pH 7.5، 12.5 mM D-biotin، PMSF) کے ساتھ الگ کیا گیا تھا اور NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris Gel (Invitrogen) پر الگ کیا گیا تھا۔سلور سٹیننگ (بیو ٹائم بائیوٹیکنالوجی) کے بعد، ایم ایس کے ذریعہ کچھ بینڈوں کو ایکسائز اور تجزیہ کیا گیا۔
Co-IP تجزیہ PACT اور PKR کے درمیان تعامل کو جانچنے کے لیے کیا گیا تھا۔مختصراً، سپرنٹنٹ لائسیٹس کو 1 x RIP بفر میں 1 x 107 lysed خلیوں کو انکیوبیٹ کر کے تیار کیا گیا تھا جس کے بعد 13,000 rpm پر 4 ° C پر 15 منٹ کے لیے سینٹرفیوگریشن کیا گیا تھا۔Lysates پروٹین A + G مقناطیسی موتیوں سے بھری ہوئی تھی، 5 µg اینٹی PACT اینٹی باڈی کے ساتھ جوڑ دی گئی تھی، اور آہستہ سے رات بھر 4°C پر گھمائی گئی تھی۔موتیوں کو 5×RIP بفر کے ساتھ 3 بار دھویا گیا، دو بار 1×RIP بفر کے ساتھ اور 1×SDS بفر سے دھویا گیا۔برآمد شدہ پروٹین کا تجزیہ SDS-PAGE جیل کے ذریعہ کیا گیا تھا اور WB نے اس کا پتہ لگایا تھا۔
جھنڈے والے PACT کے دو pmol اور PKR کے 1 pmol کو E. coli سے پاک کیا گیا تھا۔1× RIP بفر میں پتلا کریں اور 10 pmol renatured RNA کے ساتھ 4 ° C پر 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کریں۔اس کے بعد، انہیں پروٹین A+G میگنیٹک بیڈ کنجوگیٹڈ اینٹی لیبل والے اینٹی باڈی کے ساتھ اضافی دو گھنٹے کے لیے لگایا گیا۔اس کے بعد موتیوں کو 1x RIP بفر کے ساتھ چار بار دھویا گیا اور 1x SDS بفر سے ایلوٹ کیا گیا۔نتیجے میں پی اے سی ٹی اور پی کے آر کا پتہ WB نے لگایا۔