خبریں

Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے محدود CSS سپورٹ حاصل ہے۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس دوران، مسلسل تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے رینڈر کریں گے۔
متحرک ایسٹرز یا فینکسی ریڈیکلز پر مبنی انزیمیٹک قربت کے لیبلنگ کے طریقے زندہ خلیوں میں سب سیلولر پروٹوم اور پروٹین انٹرایکٹرز کا نقشہ بنانے کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال ہوتے ہیں۔تاہم، ایکٹیویٹڈ ایسٹرز کم ری ایکٹیو ہوتے ہیں، جس کے نتیجے میں ایک وسیع لیبلنگ رداس پیدا ہوتا ہے، اور پیرو آکسائیڈ ٹریٹمنٹ سے پیدا ہونے والے فینوکسی ریڈیکلز ریڈوکس کے راستوں میں مداخلت کر سکتے ہیں۔یہاں ہم ایک قربت کے لیبلنگ پر منحصر فوٹو ایکٹیویشن (PDPL) طریقہ کی اطلاع دیتے ہیں جو جینیاتی طور پر منی ایس او جی فوٹو سینسائزر پروٹین کو دلچسپی کے پروٹین سے جوڑ کر تیار کیا گیا ہے۔نیلی روشنی سے متحرک اور نمائش کے وقت کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے، سنگلٹ آکسیجن پیدا ہوتی ہے اور پھر انیلین پروب کے ذریعے ہسٹیڈائن کی باقیات کی spatiotemporally حل شدہ لیبلنگ حاصل کی جاتی ہے۔ہم آرگنیل مخصوص پروٹوم میپنگ کے ذریعے اس کی اعلی مخلصی کا مظاہرہ کرتے ہیں۔PDPL کا TurboID کے ساتھ ساتھ ساتھ موازنہ PDPL کی زیادہ مخصوص اور جامع پروٹومک کوریج کو ظاہر کرتا ہے۔اگلا، ہم نے PDPL کو بیماری سے وابستہ ٹرانسکرپشن کو ایکٹیویٹر BRD4 اور E3 Parkin ligase پر لاگو کیا اور پہلے نامعلوم انٹرایکٹرز پائے۔اوور ایکسپریشن اسکریننگ کے ذریعے، پارکن کے لیے دو نامعلوم سبسٹریٹس، Ssu72 اور SNW1 کی نشاندہی کی گئی تھی، جن کے انحطاط کو ubiquitination-proteasome پاتھ وے کے ذریعے ثالثی کیا جاتا ہے۔
پروٹین نیٹ ورکس کی درست خصوصیات بہت سے بنیادی سیلولر عمل کو زیر کرتی ہیں۔لہذا، پروٹین کے تعاملات کی انتہائی درست spatiotemporal میپنگ حیاتیاتی راستوں، بیماری کے پیتھالوجی، اور علاج کے مقاصد کے لیے ان تعاملات میں خلل ڈالنے کے لیے ایک سالماتی بنیاد فراہم کرے گی۔اس مقصد کے لیے، زندہ خلیوں یا بافتوں میں عارضی تعاملات کا پتہ لگانے کے قابل طریقے انتہائی مطلوب ہیں۔Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) تاریخی طور پر دلچسپی کے پروٹینز (POIs) کے پابند شراکت داروں کی شناخت کے لیے استعمال ہوتی رہی ہے۔مقداری پروٹومکس طریقوں کی ترقی کے ساتھ، Bioplex3.0 بنایا گیا، جو AP-MS پر مبنی پروٹین نیٹ ورکس کا سب سے بڑا ڈیٹا بیس ہے۔اگرچہ AP-MS بہت طاقتور ہے، لیکن ورک فلو میں سیل لیسز اور کمزوری کے مراحل کمزور اور عارضی پابند تعاملات کی طرف متعصب ہوتے ہیں اور lysis کے بعد کے نمونے متعارف کراتے ہیں جیسے کہ جعلی تعامل کے جوڑے جن میں lysis سے پہلے compartmentalization کی کمی ہوتی ہے۔
ان مسائل کو حل کرنے کے لیے، کراس لنکنگ گروپس کے ساتھ غیر فطری امینو ایسڈز (UAA) اور انزیمیٹک قریبی لیبلنگ (PL) پلیٹ فارمز (جیسے APEX اور BioID)5 تیار کیے گئے ہیں۔اگرچہ UAA کا طریقہ بہت سارے منظرناموں میں کامیابی کے ساتھ لاگو کیا گیا ہے اور براہ راست پروٹین چپکنے والی چیزوں کے بارے میں معلومات فراہم کرتا ہے، UAA داخل کرنے کی جگہ کی اصلاح کی ضرورت ہے۔زیادہ اہم بات یہ ہے کہ یہ ایک سٹوچیومیٹرک لیبلنگ کا طریقہ ہے جس میں لیبلنگ کے واقعات کے اتپریرک الٹ کا فقدان ہے۔اس کے برعکس، انزیمیٹک PL طریقے، جیسے BioID طریقہ، انجینئرڈ بایوٹین لیگیس کو POI7 میں فیوز کرتے ہیں، جو بعد میں بایوٹین کو فعال کر کے ایک رد عمل بایوٹینیل-اے ایم پی ایسٹر انٹرمیڈیٹ بناتا ہے۔اس طرح انزائم ایک فعال بایوٹین "کلاؤڈ" کو متحرک کرتا ہے اور جاری کرتا ہے جو قریبی لائسین کی باقیات کو لیبل کرتا ہے۔تاہم، BioID کو کافی لیبل لگا ہوا سگنل حاصل کرنے کے لیے 12 گھنٹے سے زیادہ کا وقت درکار ہوتا ہے، جو وقتی حل کے ساتھ اس کے استعمال کو روکتا ہے۔خمیر ڈسپلے پر مبنی ہدایت شدہ ارتقاء کا استعمال کرتے ہوئے، TurboID کو BioID کی بنیاد پر زیادہ موثر بنانے کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا، جس سے بایوٹین کے ساتھ 10 منٹ کے اندر موثر لیبلنگ کی اجازت دی گئی تھی، جس سے مزید متحرک عمل کا مطالعہ کیا جا سکے گا۔چونکہ TurboID انتہائی فعال ہے اور endogenous biotin کی سطحیں نچلی سطح کی لیبلنگ کے لیے کافی ہیں، پس منظر کی لیبلنگ ایک ممکنہ مسئلہ بن جاتی ہے جب exogenous biotin کے اضافے سے انتہائی بہتر اور وقتی لیبلنگ کی ضرورت ہوتی ہے۔اس کے علاوہ، چالو ایسٹرز ناقص رد عمل (t1/2 ~ 5 منٹ) ہوتے ہیں، جو ایک بڑے لیبلنگ رداس کا باعث بن سکتے ہیں، خاص طور پر بائیوٹن 5 کے ساتھ پڑوسی پروٹین کی سنترپتی کے بعد۔ ایک اور نقطہ نظر میں، انجینیئرڈ ایسکوربیٹ پیرو آکسیڈیس (یعنی بائیوٹن) کا جینیاتی فیوژن۔ فینول ریڈیکلز اور ایک منٹ 9,10 کے اندر پروٹین لیبلنگ کی اجازت دیتا ہے۔ APEX بڑے پیمانے پر سب سیلولر پروٹوم، جھلی پروٹین کمپلیکس، اور سائٹوسولک سگنلنگ پروٹین کمپلیکس 11،12 کی شناخت کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ سیلولر عمل.
اس طرح، سیلولر راستوں میں نمایاں طور پر خلل ڈالے بغیر اعلی مقامی اور وقتی درستگی کے ساتھ زیادہ ری ایکٹیو لیبل والے ریڈیئس سوپریشن پرجاتیوں کو پیدا کرنے کے قابل ایک نیا طریقہ موجودہ طریقوں میں ایک اہم اضافہ ہوگا۔ رد عمل کرنے والی نسلوں میں، سنگلٹ آکسیجن نے اپنی مختصر زندگی اور محدود پھیلاؤ کے رداس (خلیوں میں t1/2 <0.6 µs) 13 کی وجہ سے ہماری توجہ کو ابھارا۔ رد عمل کرنے والی نسلوں میں، سنگلٹ آکسیجن نے اپنی مختصر زندگی اور محدود پھیلاؤ کے رداس (خلیوں میں t1/2 <0.6 µs) 13 کی وجہ سے ہماری توجہ کو ابھارا۔ Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного ограниченного и ограниченного и ограниченного и ограниченного и ограниченного. فعال شکلوں میں، سنگلٹ آکسیجن نے اپنی مختصر زندگی اور محدود پھیلاؤ کے رداس (خلیات میں t1/2 <0.6 µs) 13 کی وجہ سے ہماری توجہ اپنی طرف مبذول کی۔在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 <0.6 µs）耬. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни , и ограниченноговкает/ فعال شکلوں میں، سنگلٹ آکسیجن اپنی مختصر زندگی اور محدود پھیلاؤ رداس (خلیوں میں t1/2 <0.6 μs) کی وجہ سے ہماری توجہ اپنی طرف مبذول کراتی ہے۔سنگل آکسیجن کو تصادفی طور پر میتھیونین، ٹائروسین، ہسٹائڈائن اور ٹرپٹوفن کو آکسائڈائز کرنے کی اطلاع دی گئی ہے، جس سے یہ امائن یا تھیول پر مبنی پروبس 16,17 سے منسلک ہونے کے لیے پولر 14,15 بنتا ہے۔اگرچہ سنگلٹ آکسیجن کا استعمال سب سیلولر کمپارٹمنٹ آر این اے کو لیبل کرنے کے لیے کیا گیا ہے، لیکن اینڈوجینس POI قربت کے مارکر کو دوبارہ تیار کرنے کی حکمت عملی ابھی تک تلاش نہیں کی گئی ہے۔یہاں، ہم فوٹو ایکٹیویشن پر منحصر قربت لیبلنگ (PDPL) کے نام سے ایک پلیٹ فارم پیش کرتے ہیں، جہاں ہم منی ایس او جی فوٹو سنسیٹائزر کے ساتھ مل کر پی او آئی کو روشن کرنے کے لیے نیلی روشنی کا استعمال کرتے ہیں اور قربت کی باقیات کو آکسائڈائز کرنے کے لیے سنگلٹ آکسیجن جنریشن کو متحرک کرتے ہیں، جس کے بعد کیمیکل پروبس میں آکسائڈائز کرنے کے لیے امائن پر مشتمل تبدیلیاں آتی ہیں۔ درمیانی زندہ خلیات..ہم نے ٹیگ کی خصوصیت کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے کیمیائی تحقیقات کے ایک گروپ کا تجربہ کیا اور اوپن پروٹومکس ورک فلو کا استعمال کرتے ہوئے ترمیم کرنے والی سائٹوں کی نشاندہی کی۔PDPL کا TurboID کے ساتھ ساتھ ساتھ موازنہ PDPL کی زیادہ مخصوص اور جامع پروٹومک کوریج کو ظاہر کرتا ہے۔ہم نے اس نقطہ نظر کو سب سیلولر پروٹوم کے آرگنیل مخصوص مارکر اور کینسر سے وابستہ ایپی جینیٹک ریگولیٹری پروٹین BRD4 اور پارکنسنز کی بیماری سے وابستہ E3 ligase پارکن کے پابند شراکت داروں کی عمومی پروٹوم شناخت پر لاگو کیا، جس نے پروٹین کے ایک معروف اور نامعلوم نیٹ ورک دونوں کی تصدیق کی۔ تعاملات.بڑے پروٹین کمپلیکس میں E3 سبسٹریٹس کو پہچاننے کی PDPL کی قابلیت ایسی صورتحال کی نمائندگی کرتی ہے جہاں بالواسطہ بائنڈرز کی پہچان ضروری ہے۔ubiquitination-proteasome کے ذریعہ ثالثی والے دو نامعلوم پارکن سبسٹریٹس کی صورتحال میں تصدیق ہوگئی ہے۔
فوٹو ڈائنامک تھراپی (PDT) 19 اور کروموفور اسسٹڈ لیزر ان ایکٹیویشن (CALI)20، جس میں فوٹو سنسیٹائزرز کے ساتھ روشنی کی شعاع ریزی سنگلٹ آکسیجن پیدا کرتی ہے، ٹارگٹ پروٹین کو غیر فعال کر سکتی ہے یا سیل کی موت کا سبب بن سکتی ہے۔چونکہ سنگلٹ آکسیجن ایک انتہائی رد عمل والا مادہ ہے جس کا نظریاتی پھیلاؤ تقریباً 70 nm کا فاصلہ ہے، اس لیے فوٹو سنسیٹائزر کے ارد گرد مقامی طور پر محدود آکسیکرن کو کنٹرول کیا جا سکتا ہے۔اس تصور کی بنیاد پر، ہم نے زندہ خلیوں میں پروٹین کمپلیکس کی قریبی لیبلنگ حاصل کرنے کے لیے سنگل آکسیجن استعمال کرنے کا فیصلہ کیا۔ہم نے چار کاموں کو پورا کرنے کے لیے ایک PDPL کیموپروٹیومک اپروچ تیار کیا ہے: (1) فعال سنگلٹ آکسیجن کی نسل کو متحرک کرنے کے لیے جو PL انزیمیٹک اپروچ کی طرح ہے۔(2) روشنی کے آغاز پر وقت کے ساتھ حل شدہ لیبلنگ فراہم کریں؛(3) تبدیلی کے ذریعے (4) پس منظر کو کم کرنے کے لیے endogenous cofactors (جیسے بایوٹین) کے استعمال سے گریز کریں، یا ماحولیاتی تناؤ سے سیل کی نمائش کو کم کرنے کے لیے انتہائی پریشان کن خارجی ریجنٹس (جیسے پیرو آکسائیڈ) استعمال کریں۔
فوٹو سنسیٹائزرز کو دو قسموں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے جس میں چھوٹے مالیکیولر ویٹ فلوروفورس (مثلاً گلاب بنگال، میتھیلین بلیو) 22 اور جینیاتی طور پر انکوڈ شدہ چھوٹے پروٹینز (مثلاً miniSOG، KillerRed) 23 شامل ہیں۔ماڈیولر ڈیزائن حاصل کرنے کے لیے، ہم نے POI24,25 (شکل 1a) میں فوٹو سنسیٹائزر (PS) پروٹینز شامل کرکے پہلی نسل کا PDPL پلیٹ فارم تیار کیا۔جب نیلی روشنی سے شعاع کیا جاتا ہے تو، سنگلٹ آکسیجن قربت کے نیوکلیوفیلک امینو ایسڈ کی باقیات کو آکسائڈائز کرتی ہے، جس کے نتیجے میں ایک امپولنگ پولرٹی ہوتی ہے جو الیکٹرو فیلک ہوتی ہے اور امائن پروب نیوکلیوفائلز16,17 کے ساتھ مزید رد عمل ظاہر کر سکتی ہے۔تحقیقات کو ایک الکائن ہینڈل کے ساتھ ڈیزائن کیا گیا ہے تاکہ کلک کیمسٹری کی اجازت دی جا سکے اور LC/MS/MS کی خصوصیت کے لیے نیچے کھینچا جا سکے۔
miniSOG کے ذریعہ ثالثی پروٹین کمپلیکس کے لیبلنگ کی منصوبہ بندی کی مثال۔نیلی روشنی کے سامنے آنے پر، miniSOG-POI کا اظہار کرنے والے خلیات سنگلٹ آکسیجن پیدا کرتے ہیں، جو بات چیت کرنے والے پروٹین کو تبدیل کرتا ہے لیکن غیر پابند پروٹین کو نہیں۔فوٹو آکسیڈیشن کی انٹرمیڈیٹ پروڈکٹس کو امائن کیمیکل پروب کے ریلے لیبلز کے ذریعے روکا جاتا ہے تاکہ ہم آہنگی پیدا کر سکے۔کیمسٹری پروب پر الکائنل گروپ پل-ڈاؤن کے ذریعے افزودگی کے لیے کلک کیمسٹری کی اجازت دیتا ہے جس کے بعد LC-MS/MS کوانٹیٹیشن ہوتا ہے۔b امائن پروبس کی کیمیائی ساخت 1-4۔c پروبس 1-4 کا استعمال کرتے ہوئے مائٹوکونڈریل لوکلائزڈ منی ایس او جی ثالثی پروٹومک مارکر کا نمائندہ فلوروسینٹ جیل تجزیہ اور جیل کثافت کی بنیاد پر رشتہ دار مقدار کا تعین۔کیمیکل پروبس کے سگنل ٹو بیک گراؤنڈ تناسب کا اندازہ نیلے رنگ کی روشنی کو چھوڑ کر منفی کنٹرول کے تجربات یا منی ایس او جی ایکسپریشن کے بغیر HEK293T سیلز کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔n = 2 حیاتیاتی طور پر آزاد نمونے۔ہر ڈاٹ ایک حیاتیاتی نقل کی نمائندگی کرتا ہے۔d نشاندہی شدہ PDPL اجزاء کی موجودگی یا غیر موجودگی میں آپٹمائزڈ پروب 3 کا استعمال کرتے ہوئے PDPL کی نمائندہ شناخت اور مقدار کا تعین جیسے c.n = 3 حیاتیاتی طور پر آزاد نمونے۔ہر ڈاٹ ایک حیاتیاتی نقل کی نمائندگی کرتا ہے۔سینٹرلائنز اور سرگوشیاں اوسط اور ± معیاری انحراف کی نمائندگی کرتی ہیں۔سی بی بی: کوماسی شاندار بلیو۔e دور تک سرخ Si-DMA داغ کے ساتھ سنگلٹ آکسیجن کی کنفوکل امیجنگ۔اسکیل بار: 10 µm۔اسی طرح کے نتائج کے ساتھ جیل امیجنگ اور کنفوکل تجربات کو آزادانہ طور پر کم از کم دو بار دہرایا گیا۔
ہم نے سب سے پہلے بالغ فوٹو سنسیٹائزرز miniSOG26 اور KillerRed23 کی قابلیت کا تجربہ کیا، جس کا واضح طور پر HEK293T میں اظہار کیا گیا ہے، تاکہ پروٹوم کی پروپارگیلامائن لیبلنگ کو کیمیائی تحقیقات کے طور پر ثالثی کیا جا سکے (ضمیمہ تصویر 1a)۔جیل فلوروسینس تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ پوری پروٹوم لیبلنگ منی ایس او جی اور بلیو لائٹ شعاع ریزی کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی گئی تھی، جب کہ KillerRed کے ساتھ لیبلنگ کی کوئی ظاہری مصنوعات نہیں دیکھی گئی۔سگنل ٹو بیک گراؤنڈ تناسب کو بہتر بنانے کے لیے، ہم نے پھر کیمیائی تحقیقات کے ایک سیٹ کا تجربہ کیا جس میں اینلین (1 اور 3)، پروپیلامین (2)، یا بینزیلامائن (4) شامل تھے۔ہم نے مشاہدہ کیا کہ HEK293T خلیات میں نیلی روشنی کے مقابلے میں خود ایک اعلی پس منظر کا سگنل تھا، ممکنہ طور پر اینڈوجینس رائبوفلاوین فوٹوسنسائٹائزر، فلیوین مونو نیوکلیوٹائڈ (FMN) 27 کی وجہ سے۔ اینیلین پر مبنی کیمیکل پروبس 1 اور 3 نے بہتر خاصیت دی، جس میں HEK293T نے مائٹوکونڈریا میں miniSOG کو مستحکم طور پر ظاہر کیا ہے جس میں پروب 3 کے لیے سگنل میں> 8 گنا اضافہ دکھایا گیا ہے، جب کہ RNA-لیبلنگ کے طریقہ کار CAP-seq میں استعمال ہونے والی پروب 2 صرف ~2.5- دکھا رہی ہے۔ فولڈ سگنل میں اضافہ، ممکنہ طور پر RNA اور پروٹین کے درمیان مختلف رد عمل کی ترجیحات کی وجہ سے (تصویر 1b، c)۔ اینیلین پر مبنی کیمیکل پروبس 1 اور 3 نے بہتر خاصیت دی، جس میں HEK293T نے مائٹوکونڈریا میں miniSOG کو مستحکم طور پر ظاہر کیا ہے جس میں پروب 3 کے لیے سگنل میں> 8 گنا اضافہ دکھایا گیا ہے، جب کہ RNA-لیبلنگ کے طریقہ کار CAP-seq میں استعمال ہونے والی پروب 2 صرف ~2.5- دکھا رہی ہے۔ فولڈ سگنل میں اضافہ، ممکنہ طور پر RNA اور پروٹین کے درمیان مختلف رد عمل کی ترجیحات کی وجہ سے (تصویر 1b، c)۔اینیلین پر مبنی کیمیائی تحقیقات 1 اور 3 نے بہتر خاصیت دکھائی: HEK293T، جو مائٹوکونڈریا میں miniSOG کو مستحکم طور پر ظاہر کرتا ہے، تحقیقات 3 کے سگنل میں 8 گنا سے زیادہ اضافہ ظاہر کرتا ہے، جبکہ پروب 2، CAP-seq RNA لیبلنگ کے طریقہ کار میں استعمال ہوتا ہے، صرف ~2.5 گنا سگنل میں اضافہ دکھاتا ہے، شاید RNA اور پروٹین کے درمیان مختلف رد عمل کی ترجیحات کی وجہ سے (تصویر 1b، c)۔基于 苯胺 化学 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 好 的 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 中 中 稳定 表达 表达 表达 Minisog ， 探针 3 信号 增加 增加 增加> 8 倍 而 而 用 用 于 于 于 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 方法 而 而 用 用 方法 方法 方法 方法 而 而 而 用 方法 方法 方法 方法 而 而 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 用 用 用 用 用 用 用 用 用 用 用 用 用 用 用 用2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b،c）۔基于 苯胺 化学 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 的 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 稳定 表达 Minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加 增加 而 于 于 于 于 rna 标记 CAP-Eq 的 2 仅 仅 仅 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ - 倍信号增加，可能是由于RNAاینیلین پر مبنی کیمیائی تحقیقات 1 اور 3 نے بہتر خصوصیت کی تھی، HEK293T نے مائٹوکونڈریا میں miniSOG کو مستحکم طور پر ظاہر کیا تھا، اور پروب 3 نے سگنل میں 8 گنا سے زیادہ اضافہ کیا تھا، جبکہ CAP-seq RNA لیبلنگ کے طریقہ کار کے لیے پروب 2 میں صرف ~ 2.5 گنا اضافہ ہوا تھا۔سگنل میں، شاید RNA اور پروٹین کے درمیان مختلف رد عمل کی ترجیحات کی وجہ سے (تصویر 1b، c)۔اس کے علاوہ، پروب 3 آئیسومر اور ہائیڈرزائن پروبس (تحقیقات 5، 6، 7) کا تجربہ کیا گیا، جو پروب 3 کی اصلاح کی تصدیق کرتے ہیں (ضمیمہ تصویر 1b،c)۔اسی طرح، جیل میں فلوروسینس تجزیہ نے دیگر بہتر تجرباتی پیرامیٹرز کا انکشاف کیا: شعاع ریزی طول موج (460 nm)، کیمیائی تحقیقات کا ارتکاز (1 mM)، اور شعاع ریزی کا وقت (20 منٹ) (ضمنی شکل 2a–c)۔PDPL پروٹوکول میں کسی بھی جزو یا قدم کو چھوڑنے کے نتیجے میں اہم سگنل پس منظر میں تبدیل ہو گئے (تصویر 1d)۔خاص طور پر، سوڈیم ایزائڈ یا ٹرالوکس کی موجودگی میں پروٹین لیبلنگ میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی، جو سنگل آکسیجن کو بجھانے کے لیے جانا جاتا ہے۔D2O کی موجودگی، جو سنگل آکسیجن کو مستحکم کرنے کے لیے جانا جاتا ہے، لیبلنگ سگنل کو بڑھاتا ہے۔لیبلنگ میں دیگر رد عمل والی آکسیجن پرجاتیوں کے تعاون کی تحقیقات کے لیے، مینیٹول اور وٹامن سی کو بالترتیب 18، 29، ہائیڈروکسیل اور سپر آکسائیڈ ریڈیکل اسکیوینجرز قائم کرنے کے لیے شامل کیا گیا، لیکن وہ لیبلنگ کو کم کرنے کے لیے نہیں پائے گئے۔H2O2 کا اضافہ، لیکن روشنی نہیں، اس کے نتیجے میں لیبلنگ نہیں ہوئی (ضمیمہ تصویر 3a)۔Si-DMA تحقیقات کے ساتھ فلوروسینس سنگل آکسیجن امیجنگ نے HEK293T-miniSOG تار میں سنگلٹ آکسیجن کی موجودگی کی تصدیق کی، لیکن اصل HEK293T تار میں نہیں۔مزید برآں، mitoSOX Red روشنی کے بعد سپر آکسائیڈ کی پیداوار کا پتہ نہیں لگا سکا (تصویر 1e اور ضمنی شکل 3b)PDPL کی سائٹوٹوکسیٹی کا اندازہ لگایا گیا جس میں نیلی روشنی کی شعاع ریزی اور کیمیائی تحقیقات شامل ہیں، اور کوئی قابل ذکر سائٹوٹوکسٹی نہیں دیکھی گئی (ضمیمہ تصویر 4a)۔
لیبلنگ میکانزم کا مطالعہ کرنے اور LC-MS/MS کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کمپلیکس کی پروٹومک شناخت کو فعال کرنے کے لیے، ہمیں پہلے یہ تعین کرنے کی ضرورت ہے کہ کون سے امینو ایسڈز میں ترمیم کی گئی ہے اور پروب لیبلز کا ڈیلٹا ماس۔میتھیونین، ہسٹائڈائن، ٹرپٹوفن اور ٹائروسین کو سنگلٹ آکسیجن 14,15 کے ذریعے تبدیل کرنے کی اطلاع ملی ہے۔ہم TOP-ABPP31 ورک فلو کو MSFragger32 پر مبنی FragPipe کمپیوٹنگ پلیٹ فارم کے ذریعہ فراہم کردہ غیر جانبدارانہ کھلی تلاش کے ساتھ مربوط کرتے ہیں۔سنگلٹ آکسیجن میں ترمیم اور کیمیکل پروب لیبلنگ کے بعد، کلک کیمسٹری کو بائیوٹن ریڈکشن لیبل کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا جس میں کلیو ایبل لنکر تھا، اس کے بعد نیوٹراویڈن اسٹریچنگ اور ٹرپسن ہاضمہ۔ترمیم شدہ پیپٹائڈ، جو اب بھی رال کے ساتھ پابند ہے، LC-MS/MS تجزیہ (شکل 2a اور ضمنی ڈیٹا 1) کے لیے فوٹوکلیوڈ تھا۔50 سے زیادہ پیپٹائڈ میپ (PSM) کے میچوں کے ساتھ پورے پروٹوم میں بڑی تعداد میں ترمیم ہوئی (تصویر 2b)۔حیرت انگیز طور پر، ہم نے صرف ہسٹائڈائن میں ترمیم کا مشاہدہ کیا، غالباً دیگر امینو ایسڈز کے مقابلے انیلین پروب کی طرف آکسیڈائزڈ ہسٹائڈائن کی زیادہ رد عمل کی وجہ سے۔سنگلٹ آکسیجن کے ذریعہ ہسٹائڈائن آکسیڈیشن کے شائع شدہ طریقہ کار کے مطابق، 21,33 +229 Da کا مجوزہ ڈیلٹا ماس ڈھانچہ دو آکسیڈیشن کے بعد 2-oxo-histidine کے ساتھ پروب 3 کے اضافے سے مطابقت رکھتا ہے، جبکہ +247 Da ہائیڈرولیسس پروڈکٹ ہے۔ +229 Da (ضمنی شکل 5)۔MS2 سپیکٹرم کی تشخیص نے زیادہ تر y اور b آئنوں کی شناخت کی ایک اعلی وشوسنییتا کو ظاہر کیا، بشمول ترمیم شدہ فریگمنٹ آئنوں (y اور b) کی شناخت (تصویر 2c)۔PDPL میں ترمیم شدہ ہسٹیڈائنز کی مقامی ترتیب کے سیاق و سباق کے تجزیے سے ±1 پوزیشنوں پر چھوٹے ہائیڈروفوبک باقیات کے لیے ایک اعتدال پسند ترجیح کا انکشاف ہوا (ضمیمہ تصویر 4b)۔اوسطاً، فی پروٹین 1.4 ہسٹیڈائنز کی نشاندہی کی گئی تھی، اور ان مارکروں کی جگہوں کا تعین سالوینٹ قابل رسائی سطح کے علاقے (SASA) اور رشتہ دار سالوینٹ دستیابی (RSA) تجزیہ (ضمنی شکل 4c،d) کے ذریعے کیا گیا تھا۔
MSFragger کے ذریعے تقویت یافتہ FragPipe کمپیوٹنگ پلیٹ فارم کا استعمال کرتے ہوئے بقایا انتخاب کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک غیر جانبدارانہ ورک فلو۔کلیو ایبل لنکرز کلک کیمسٹری میں استعمال کیے جاتے ہیں تاکہ اسٹریپٹاویڈن رال سے ترمیم شدہ پیپٹائڈس کی فوٹوکلیویج کی اجازت دی جا سکے۔متعدد ترمیمات کے ساتھ ساتھ متعلقہ باقیات کی شناخت کے لیے ایک کھلی تلاش شروع کی گئی۔b پورے پروٹوم میں ہونے والی تبدیلیوں کے بڑے پیمانے کو تفویض کریں۔پیپٹائڈ میپنگ PSM۔c MS2 پروب 3 کے ساتھ ترمیم شدہ ہسٹائڈائن سائٹس کی سپیکٹرل تشریح۔ ایک نمائندہ مثال کے طور پر، پروب 3 کے ساتھ ایک ہم آہنگی ردعمل نے ترمیم شدہ امینو ایسڈ میں +229.0938 Da کا اضافہ کیا۔d اتپریورتن پرکھ PDPL مارکر کی جانچ کے لیے استعمال ہوتی ہے۔PRDX3 (H155A, H225A) اور PRDX1 (H10A, H81A, H169A) کو اینٹی فلیگ کا پتہ لگانے کے لیے جنگلی قسم کے پلازمیڈ سے تبدیل کیا گیا تھا۔e مصنوعی پیپٹائڈ پروب 3 کی موجودگی میں پیوریفائیڈ منی ایس او جی کے ساتھ رد عمل ظاہر کیا گیا اور Δm +247 اور +229 کے ساتھ متعلقہ مصنوعات LC-MS سپیکٹرم میں نوٹ کی گئیں۔f ان وٹرو پروٹین سے پروٹین کے تعاملات جو miniSOG-6xHis-tag اور anti-6xHis اینٹی باڈی کے ساتھ بنائے گئے ہیں۔اینٹی بائیوٹن (اسٹریپٹاویڈن-ایچ آر پی) اور miniSOG-6xHis/anti-6xHis اینٹی باڈی کمپلیکس کا اینٹی ماؤس ویسٹرن بلٹ تجزیہ روشنی کے سامنے آنے کے وقت پر منحصر ہے، پروب 3 کے ساتھ لیبل لگا ہوا ہے۔انفرادی پروٹین کے لیبلز کو متعلقہ مالیکیولر وزن میں ظاہر کیا جاتا ہے: LC اینٹی باڈی لائٹ چین، HC اینٹی باڈی ہیوی چین۔ان تجربات کو آزادانہ طور پر اسی طرح کے نتائج کے ساتھ کم از کم دو بار دہرایا گیا۔
لیبلنگ سائٹ کی بائیو کیمیکل تصدیق کے لیے، ماس اسپیکٹومیٹری کے ذریعے شناخت شدہ PRDX3 اور PRDX1 کو ہسٹیڈائن سے الانائن میں تبدیل کیا گیا اور ٹرانسفیکشن اسسیس میں جنگلی قسم کے مقابلے کر دیا گیا۔پی ڈی پی ایل کے نتائج نے ظاہر کیا کہ اتپریورتن نے لیبلنگ کو نمایاں طور پر کم کیا (تصویر 2 ڈی)۔دریں اثنا، کھلی تلاش میں شناخت شدہ پیپٹائڈ کے سلسلے کو وٹرو میں پیوریفائیڈ منی ایس او جی کے ساتھ پروب 3 اور نیلی روشنی کی موجودگی میں ترکیب کیا گیا اور رد عمل ظاہر کیا گیا، جس سے LC-MS کے ذریعے پتہ چلنے پر +247 اور +229 Da کی بڑے پیمانے پر شفٹ کے ساتھ مصنوعات برآمد ہوئیں۔ 2e)۔)۔یہ جانچنے کے لیے کہ آیا miniSOG فوٹو ایکٹیویشن کے جواب میں پراکسیمل پروٹینز کو وٹرو میں لیبل لگایا جا سکتا ہے، ہم نے miniSOG-6xHis پروٹین اور وٹرو میں ایک اینٹی ہز مونوکلونل اینٹی باڈی (شکل 2f) کے درمیان تعامل کے ذریعے ایک مصنوعی قربت پرکھ ڈیزائن کیا۔اس پرکھ میں، ہم نے miniSOG کے ساتھ اینٹی باڈی بھاری اور ہلکی زنجیروں کی قربت کی لیبلنگ کی توقع کی۔درحقیقت، اینٹی ماؤس (اینٹی 6xHis کے لیبل والے اینٹی باڈی کی بھاری اور ہلکی زنجیروں کو پہچاننا) اور اسٹریپٹاویڈن ویسٹرن بلاٹس نے بھاری اور ہلکی زنجیروں کی مضبوط بایوٹینیلیشن ظاہر کی۔خاص طور پر، ہم نے 6xHis ٹیگ اور روشنی اور بھاری زنجیروں کے درمیان کراس لنکس کی وجہ سے miniSOG آٹو بائیوٹینیلیشن کو دیکھا، جو لائسین اور 2-oxo-histidine قربت کے ردعمل کے درمیان پہلے بیان کردہ فرق سے متعلق ہو سکتا ہے۔آخر میں، ہم یہ نتیجہ اخذ کرتے ہیں کہ PDPL قربت پر منحصر انداز میں ہسٹائڈائن کو تبدیل کرتا ہے۔
ہمارا اگلا مقصد سیٹو لیبلنگ کی خصوصیت کو جانچنے کے لئے ذیلی سیلولر پروٹوم کی خصوصیت کرنا تھا۔لہذا، ہم نے نیوکلئس، مائٹوکونڈریل میٹرکس، یا HEK293T خلیات (تصویر 3a) کی بیرونی ER جھلی میں miniSOG کو مستحکم طور پر ظاہر کیا۔جیل فلوروسینس تجزیہ سے تین ذیلی سیلولر مقامات پر لیبل والے بینڈ کے ساتھ ساتھ مختلف لیبلنگ پیٹرن (تصویر 3b) کا انکشاف ہوا۔فلوروسینس امیجنگ تجزیہ نے PDPL (تصویر 3c) کی اعلی خصوصیات کو ظاہر کیا۔PDPL ورک فلو کے بعد فلوروسینس مائکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے ذیلی سیلولر پروٹوم کی وضاحت کرنے کے لیے روڈامین رنگوں کے ساتھ کلک ری ایکشنز کیے گئے، اور PDPL سگنلز کو DAPI، mitochondrial trackers، یا ER ٹریکرز کے ساتھ جمع کیا گیا، PDPL کی اعلی مخلصی کی تصدیق کرتے ہوئے۔تینوں آرگنیل مقامات کے لیے، PDPL کا turboID کے ساتھ avidin ویسٹرن بلاٹ کا استعمال کرتے ہوئے ایک دوسرے کے ساتھ موازنہ ظاہر کرتا ہے کہ PDPL کو ان کے متعلقہ کنٹرولز کے مقابلے میں خاص طور پر لیبل لگایا گیا تھا۔پی ڈی پی ایل کے حالات میں، مزید لیبل والے بینڈ نمودار ہوئے، جو مزید پی ڈی پی ایل لیبل والے پروٹین کی نشاندہی کرتے ہیں (ضمنی شکل 6a-d)۔
منی ایس او جی ثالثی آرگنیل مخصوص پروٹوم لیبلنگ کی منصوبہ بندی کی نمائندگی۔miniSOG مائٹوکونڈریل میٹرکس کو فیوژن کے ذریعے انسانی COX4 (mito-miniSOG) کے N-ٹرمینل 23 امینو ایسڈز، نیوکلئس کو فیوژن کے ذریعے H2B (نیوکلئس-miniSOG) اور Sec61β کو ER جھلی (ER-miniSOG) کے سائٹوپلاسمک سائیڈ کے ذریعے نشانہ بناتا ہے۔ )۔اشارے میں جیل امیجنگ، کنفوکل امیجنگ، اور ماس اسپیکٹومیٹری شامل ہیں۔b تین آرگنیل مخصوص PDPL پروفائلز کی نمائندہ جیل کی تصاویر۔CBB Coomassie شاندار بلیو۔c HEK293T خلیوں کی نمائندہ کنفوکل تصاویر جو V5 (سرخ) کے لیبل والے اینٹی باڈی کے ذریعہ پائے جانے والے مختلف ذیلی سیلولر لوکلائزیشن کے ساتھ miniSOG کو مستحکم طور پر ظاہر کرتی ہیں۔سب سیلولر مارکر مائٹوکونڈریا اور ER (سبز) کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔PDPL ورک فلو میں Cy3-azide کلک کیمسٹری کا استعمال کرتے ہوئے miniSOG (پیلا) لیبل والے سب سیلولر پروٹوم کا پتہ لگانا شامل ہے۔اسکیل بار: 10 µm۔d مختلف آرگنیلز میں PDPL-ٹیگ شدہ پروٹوم کے آتش فشاں پلاٹوں کی مقدار بغیر لیبل والے مقدار کے ذریعے طے کی گئی ہے (n = 3 آزاد حیاتیاتی تجربات)۔دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ آتش فشاں پلاٹوں پر استعمال کیا گیا تھا۔HEK293T جنگلی قسم کو منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹین کو سرخ رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے (p <0.05 اور> 2 گنا آئن کی شدت کا فرق)۔ نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹین کو سرخ رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے (p <0.05 اور> 2 گنا آئن کی شدت کا فرق)۔ Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов)۔ نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹین کو سرخ رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے (p <0.05 اور> آئن کی شدت میں 2 گنا فرق)۔显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе)۔ نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹین کو سرخ رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے (p <0.05 اور > آئنک طاقت میں 2 گنا فرق)۔متعلقہ پروٹین HEK293T-miniSOG کے لیے اہم ہیں لیکن HEK293T کے لیے اہم نہیں سبز رنگ میں دکھائے گئے ہیں۔e تجربات سے پروٹومک ڈیٹاسیٹس کی مخصوصیت کا تجزیہ d۔ہر آرگنیل (سرخ اور سبز نقطوں) میں شماریاتی لحاظ سے اہم پروٹین کی کل تعداد سب سے اوپر نشان زد ہے۔ہسٹوگرامز مائٹو کارٹا 3.0، GO تجزیہ اور A. Ting et al کی بنیاد پر آرگنیلز میں مقامی پروٹین دکھاتے ہیں۔لوگمائٹوکونڈریا، نیوکللی، اور ER کے لیے علیحدہ ڈیٹا سیٹ۔ان تجربات کو آزادانہ طور پر اسی طرح کے نتائج کے ساتھ کم از کم دو بار دہرایا گیا۔خام ڈیٹا خام ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔
جیل اور امیجنگ کے نتائج سے حوصلہ افزائی کرتے ہوئے، لیبل فری مقدار کا استعمال ہر آرگنیل میں شناخت شدہ پروٹوم کی مقدار درست کرنے کے لیے کیا گیا تھا (ضمنی ڈیٹا 2)۔غیر منتقلی HEK293T کو پس منظر کے مارکر کو گھٹانے کے لیے منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ آتش فشاں پلاٹ کے تجزیے میں نمایاں طور پر افزودہ پروٹینز (p <0.05 اور >2 گنا آئن کی شدت) کے ساتھ ساتھ سنگلٹن پروٹین بھی دکھائے گئے جو صرف miniSOG-اظہار کرنے والی لائنوں میں موجود ہیں (تصویر 3d سرخ اور سبز نقطے)۔ آتش فشاں پلاٹ کے تجزیے میں نمایاں طور پر افزودہ پروٹینز (p <0.05 اور >2 گنا آئن کی شدت) کے ساتھ ساتھ سنگلٹن پروٹین بھی دکھائے گئے جو صرف miniSOG-اظہار کرنے والی لائنوں میں موجود ہیں (تصویر 3d سرخ اور سبز نقطے)۔ Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). آتش فشاں پلاٹ کے تجزیے میں نمایاں طور پر افزودہ پروٹینز (p<0.05 اور>2-fold ion intensity) کے ساتھ ساتھ واحد پروٹین جو صرف miniSOG- اظہار کرنے والی لائنوں (تصویر 3d، سرخ اور سبز نقطوں) میں موجود ہوتے ہیں۔火山图 分析 出 出 显着 富集 的 蛋白质 （P <0.05 和> 2 倍 强度 强度 以及 仅 存 存 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 （（（3d 红色 和 绿色点）。火山图 分析 出 显着 显着 的 （（P <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 图 3d 红色 。。。 。。。）））））））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). آتش فشاں پلاٹ کے تجزیے سے نمایاں طور پر افزودہ پروٹینز (p <0.05 اور >2x ionic طاقت) کے ساتھ ساتھ واحد پروٹین کا انکشاف ہوا جو صرف miniSOG ایکسپریشن لائن میں موجود ہیں (تصویر 3d میں سرخ اور سبز نقطے)۔ان اعداد و شمار کو یکجا کرتے ہوئے، ہم نے بالترتیب 1364، 461، اور 911 شماریاتی طور پر اہم جوہری، مائٹوکونڈریل، اور ER بیرونی جھلی پروٹین کی نشاندہی کی۔organelle-localized PDPL کی درستگی کا تجزیہ کرنے کے لیے، ہم نے MitoCarta 3.0، Gene Ontology (GO) تجزیہ، اور A. Ting et al کا استعمال کیا۔ڈیٹا سیٹ 8 کو مائٹوکونڈریا، نیوکلئس، اور ER کے لیے استعمال کیا گیا تھا تاکہ پتہ چلنے والے پروٹینوں کی آرگنیل مخصوصیت کو جانچا جا سکے، جو کہ 73.4، 78.5، اور 73.0% (تصویر 3e) کی درستگی کے مطابق ہے۔پی ڈی پی ایل کی خصوصیت اس بات کی تصدیق کرتی ہے کہ پی ڈی پی ایل آرگنیل مخصوص پروٹوم کی شناخت کے لیے ایک مثالی ٹول ہے۔خاص طور پر، شناخت شدہ مائٹوکونڈریل پروٹینوں کے سبوکونڈریل تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ پھنسے ہوئے پروٹوم کو بنیادی طور پر میٹرکس اور اندرونی جھلی (بالترتیب 226 اور 106) میں تقسیم کیا گیا تھا، جس میں شناخت شدہ مائٹوکونڈریل پروٹین کی کل تعداد کا 91.7٪ (362) حصہ تھا۔PDPL کی ایک اعلی سطح کی اضافی طور پر تصدیق کی گئی تھی (ضمنی شکل 7a)۔اسی طرح، ذیلی نیوکلیئر تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ پکڑے گئے پروٹوم کو بنیادی طور پر نیوکلئس، نیوکلیوپلاسم، اور نیوکلیولس (ضمیمہ تصویر 7b) میں تقسیم کیا گیا تھا۔نیوکلیئر لوکلائزیشن سگنل پیپٹائڈ (3xNLS) کے ساتھ نیوکلیئر پروٹومک تجزیہ نے H2B کی تعمیر (ضمیمہ تصویر 7c–h) سے ملتی جلتی درستگی ظاہر کی۔PDPL مارکر کی مخصوصیت کا تعین کرنے کے لیے، نیوکلیئر لامینین A کو زیادہ مجرد مقامی POI7 ٹریپ کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔PDPL نے نمایاں طور پر افزودہ 36 پروٹینوں کی نشاندہی کی، جن میں سے 12 پروٹین (30.0% بشمول lamin A) سٹرنگ ڈیٹا بیس کے ذریعے تشریح کردہ اچھی خاصیت والے لامین A انٹرایکٹنگ پروٹینز تھے، جن میں BioID طریقہ (122 پروٹین) سے زیادہ فیصد 28 میں سے 28، 22.9 تھے۔ %) 7. ہمارے طریقہ کار نے کم پروٹین کی نشاندہی کی، ممکنہ طور پر محدود لیبلنگ ایریاز کی وجہ سے، جو زیادہ فعال سنگلٹ آکسیجن کی وجہ سے ممکن ہوا۔GO تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ شناخت شدہ پروٹین بنیادی طور پر نیوکلیوپلازم (26)، جوہری جھلی (10)، جوہری جھلی (9)، اور جوہری سوراخ (5) میں واقع تھے۔اجتماعی طور پر، یہ جوہری مقامی پروٹینز افزودہ پروٹینوں کا 80% بنتے ہیں، جو مزید PDPL کی خصوصیت کو ظاہر کرتے ہیں (ضمیمہ تصویر 8a–d)۔
پی ڈی پی ایل کی آرگنیلز میں قربت کی نشاندہی کرنے کی صلاحیت کو قائم کرنے کے بعد، ہم نے پھر جانچ کی کہ آیا پی ڈی پی ایل کو پی او آئی بائنڈنگ شراکت داروں کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔خاص طور پر، ہم نے سائٹوسولک پروٹینز کے PDPL تجزیہ کی وضاحت کرنے کی کوشش کی، جو ان کی انتہائی متحرک نوعیت کی وجہ سے ان کے جھلی کے مقامی ہم منصبوں سے زیادہ مشکل اہداف سمجھے جاتے ہیں۔بروموڈومین اور ایکسٹراٹرمینل (BET) پروٹین BRD4 نے مختلف بیماریوں میں اپنے کلیدی کردار کے لیے ہماری توجہ مبذول کرائی ہے 35, 36۔BRD4 کے ذریعہ تشکیل کردہ کمپلیکس ایک ٹرانسکرپشن کو ایکٹیویٹر اور ایک اہم علاج کا ہدف ہے۔c-myc اور Wnt5a ٹرانسکرپشن عوامل کے اظہار کو منظم کرتے ہوئے، BRD4 کو ایکیوٹ مائیلوڈ لیوکیمیا (AML)، ایک سے زیادہ مائیلوما، برکٹز لیمفوما، بڑی آنت کا کینسر اور سوزش کی بیماریوں کا کلیدی عامل سمجھا جاتا ہے۔اس کے علاوہ، کچھ وائرس وائرل اور سیلولر ٹرانسکرپشن کو منظم کرنے کے لیے BRD4 کو نشانہ بناتے ہیں، جیسے پیپیلوما وائرس، ایچ آئی وی، اور SARS-CoV-236,39۔
PDPL کا استعمال کرتے ہوئے BRD4 تعامل کا نقشہ بنانے کے لیے، ہم نے miniSOG کو BRD4 کے مختصر N- یا C-ٹرمینل isoform کے ساتھ ملایا۔پروٹومک نتائج نے دونوں تعمیرات کے درمیان اعلی درجے کے اوورلیپ کا انکشاف کیا (ضمنی شکل 9a)۔miniSOG-H2B کے ساتھ شناخت شدہ جوہری پروٹوم BRD4 (ضمنی شکل 9b) کے ساتھ تعامل کرنے والے 77.6% پروٹین کا احاطہ کرتا ہے۔پھر، روشنی کے مختلف اوقات (2، 5، 10، 20 منٹ) مارکر کے رداس کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے استعمال کیے گئے (تصویر 4a اور ضمنی ڈیٹا 3)۔ہم یہ نتیجہ اخذ کرتے ہیں کہ مختصر فوٹو پیریڈز پر، PDPL بنیادی طور پر براہ راست بائنڈنگ پارٹنرز کو لیبل کرے گا، جب کہ طویل عرصے میں چھوٹے فوٹو ایکٹیویشن ادوار کے دوران شناخت کیے گئے پروٹین کے ساتھ ساتھ لیبلنگ کمپلیکس میں بالواسطہ اہداف شامل ہوں گے۔درحقیقت، ہم نے ملحقہ ٹائم پوائنٹس کے درمیان مضبوط اوورلیپ پایا (2 اور 5 منٹ کے لیے 84.6%؛ 5 اور 10 منٹ کے لیے 87.7%؛ 10 اور 20 منٹ کے لیے 98.7%) (تصویر 4b اور ضمنی شکل 9c)۔تمام تجرباتی گروپوں میں، ہم نے نہ صرف BRD4 خود لیبلنگ پایا، بلکہ کئی معلوم اہداف جیسے MED1، CHD8، BICRA، NIPBL، SMC1A، اور HMGB1 کو سٹرنگ ڈیٹا بیس میں بیان کیا گیا ہے۔ان اہداف کی آئنک طاقت نمائش کے وقت کے متناسب ہے (تصویر 4c اور ضمنی شکل 9d)۔2 منٹ کے گروپ میں شناخت شدہ پروٹینوں کے GO تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ شناخت شدہ پروٹین نیوکلئس میں مقامی تھے اور کرومیٹن ریموڈلنگ اور آر این اے پولیمریز فنکشن میں شامل تھے۔پروٹین کا مالیکیولر فنکشن کرومیٹن بائنڈنگ یا ٹرانسکریشنل کو ایکٹیویشن میں افزودہ تھا، BRD4 فنکشن (تصویر 4d) کے مطابق۔سٹرنگ ڈیٹا بیس سے چلنے والے پروٹین کے تعامل کے تجزیے نے BRD4 اور HDAC فیملی کے تعامل کرنے والے کمپلیکس جیسے SIN3A، NCOR2، BCOR، اور SAP130 (تصویر 4e اور سپلیمنٹری تصویر 9e) کے درمیان بالواسطہ تعامل کی پہلی سطح کا انکشاف کیا، BRD4 اور HDAC بائنڈنگ ایسٹیلیٹڈ اس کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔ ..اس کے علاوہ، LC-MS/MS کے ذریعے جن نمائندہ اہداف کی نشاندہی کی گئی ہے، بشمول Sin3A، NSUN2، Fus، اور SFPQ، کی تصدیق مغربی بلوٹنگ (تصویر 4f) سے ہوئی۔حال ہی میں، BRD4 کے مختصر isoform کو مائع-مائع مرحلے کی علیحدگی (LLPS) خصوصیات کے ساتھ نیوکلی بنانے کی اطلاع ملی ہے۔RNA بائنڈنگ پروٹینز Fus اور SFPQ مختلف سیلولر پروسیسز کے LLPS میں ثالثی کرتے ہیں اور ان کی شناخت یہاں غیر ریکارڈ شدہ BRD4 بائنڈنگ پروٹین کے طور پر کی گئی ہے۔BRD4 اور SFPQ کے درمیان تعامل کی تصدیق co-immunoprecipitation (co-IP) تجربات (شکل 4g) سے ہوئی، جس میں BRD4 کی ثالثی سے مائع فیز علیحدگی کے لیے ایک اور طریقہ کار تجویز کیا گیا جو مزید تفتیش کا مستحق ہے۔ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ PDPL معروف BRD4 بات چیت کے ساتھ ساتھ نامعلوم بائنڈنگ پروٹین کی شناخت کے لیے ایک مثالی پلیٹ فارم ہے۔
miniSOG ثالثی BRD4 قربت کے نشانات، نمائش کے اوقات: 2، 5، 10، اور 20 منٹ کی منصوبہ بندی کی نمائندگی۔b مختلف روشنی کے اوقات میں شناخت شدہ پروٹین کا اوورلیپ۔HEK293T-miniSOG-BRD4 میں شناخت شدہ پروٹین کی افزودگی جنگلی قسم کے HEK293T کے مقابلے میں شماریاتی لحاظ سے اہم تھی۔c آئن کی شدت جب مخصوص نمائش کے وقت کے دوران بغیر لیبل والے نمائندے کے نام سے جانا جاتا BRD4-بائنڈنگ پروٹین کی مقدار کا تعین کرتے ہیں۔n = 3 حیاتیاتی طور پر آزاد نمونے۔ڈیٹا کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔d 2 منٹ کے گروپ میں شناخت شدہ پروٹین کا جین آنٹولوجیکل تجزیہ (GO)۔پہلی دس GO شرائط درج ہیں۔بلبلے GO اصطلاح کے زمرے کے مطابق رنگین ہوتے ہیں، اور بلبلے کا سائز ہر اصطلاح میں پائے جانے والے پروٹینوں کی تعداد کے متناسب ہوتا ہے۔ای BRD4 کے ساتھ تعامل کرنے والے پروٹینوں کا سٹرنگ تجزیہ۔پیلے رنگ کے دائرے براہ راست گلو ہیں اور سرمئی حلقے بالواسطہ گلو کی پہلی پرت ہیں۔سرخ لکیریں تجرباتی طور پر طے شدہ تعاملات کی نمائندگی کرتی ہیں اور نیلی لکیریں پیش گوئی شدہ تعاملات کی نمائندگی کرتی ہیں۔f LC-MS/MS میں شناخت شدہ BRD4 بائنڈنگ اہداف کی تصدیق مغربی بلوٹنگ سے ہوئی۔g Co-immunoprecipitation تجربات SFPQ اور BRD4 کے درمیان تعامل کی تصدیق کرتے ہیں۔ان تجربات کو آزادانہ طور پر اسی طرح کے نتائج کے ساتھ کم از کم دو بار دہرایا گیا۔خام ڈیٹا خام ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔
غیر رجسٹرڈ POI سے وابستہ اہداف کی نشاندہی کرنے کے علاوہ، ہم یہ قیاس کرتے ہیں کہ PDPL انزائمز کے لیے ذیلی ذخیرے کی شناخت کے لیے موزوں ہو گا، جس کے لیے غیر رجسٹرڈ سبسٹریٹس کو تشریح کرنے کے لیے بڑے کمپلیکس میں بالواسطہ بائنڈنگ پروٹین کی خصوصیت کی ضرورت ہوگی۔پارکن (PARK2 کے ذریعہ انکوڈ شدہ) ایک E3 ligase ہے اور پارکن میں تغیرات آٹوسومل ریسیسیو نوعمر پارکنسنز کی بیماری (AR-JP)42 کا سبب بنتے ہیں۔اس کے علاوہ، پارکن کو mitophagy (mitochondrial autophagy) اور رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کو ہٹانے کے لیے ضروری قرار دیا گیا ہے۔تاہم، اگرچہ پارکن کے متعدد ذیلی ذخائر کی نشاندہی کی گئی ہے، لیکن اس بیماری میں پارکن کا کردار ابھی تک واضح نہیں ہے۔اس کے غیر خصوصیت والے ذیلی ذخائر کی تشریح کرنے کے لیے، PDPL کو پارکن کے N- یا C-ٹرمنس میں miniSOG شامل کر کے ٹیسٹ کیا گیا۔PINK1-Parkin پاتھ وے کے ذریعے پارکن کو چالو کرنے کے لیے خلیوں کا علاج کاربونیل سائینائیڈ پروٹون ٹرانسپورٹر ایم-کلوروفینیل ہائیڈرازون (CCCP) سے کیا گیا۔ہمارے BRD4 PDPL نتائج کے مقابلے میں، پارکن این ٹرمینس فیوژن نے ٹارگٹ پروٹینز کے ایک بڑے سیٹ کا انکشاف کیا، حالانکہ اس میں C-ٹرمینس (210 میں سے 177) (شکل 5a، b اور ضمنی ڈیٹا 4) کا ایک بڑا حصہ شامل ہے۔نتیجہ ان رپورٹس سے مطابقت رکھتا ہے کہ N-ٹرمینل ٹیگز پارکن44 کو غیر معمولی طور پر فعال کر سکتے ہیں۔حیرت کی بات یہ ہے کہ ہمارے ڈیٹا میں Parkin43 کے شائع شدہ AP-MS نتائج کے ساتھ صرف 18 اوور لیپنگ پروٹین تھے، ممکنہ طور پر سیل لائنوں اور پروٹومکس ورک فلو کے درمیان فرق کی وجہ سے۔چار معروف پروٹین کے علاوہ (ARDM1, HSPA8, PSMD14, اور PSMC3) دو طریقوں سے شناخت شدہ (تصویر 5c)43۔LC-MS/MS کے نتائج کی مزید توثیق کرنے کے لیے، PDPL علاج اور اس کے نتیجے میں مغربی بلوٹنگ کا استعمال HEK293T پیرنٹ سیل پرکھ اور مستحکم N-ٹرمینل پارکن لائن کے نتائج کا موازنہ کرنے کے لیے کیا گیا۔پہلے نامعلوم اہداف CDK2، DUT، CTBP1، اور PSMC4 کا تجربہ ایک معروف بائنڈر، DNAJB1 (تصویر 5d) سے کیا گیا تھا۔
HEK293T خلیوں میں پارکن سے تعامل کرنے والے پروٹینوں کا آتش فشاں پلاٹ جو پارکن کے N- یا C-ٹرمینس (n = 3 آزاد حیاتیاتی تجربات) کے ساتھ مستحکم طور پر اظہار کردہ miniSOG کے ساتھ ملا ہوا ہے۔دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ آتش فشاں پلاٹوں پر استعمال کیا گیا تھا۔HEK293T کو منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹین کو سرخ رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے (p <0.05 اور> 2 گنا آئن کی شدت کا فرق)۔ نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹین کو سرخ رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے (p <0.05 اور> 2 گنا آئن کی شدت کا فرق)۔ Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов)۔ نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹین کو سرخ رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے (p <0.05 اور> آئن کی شدت میں 2 گنا فرق)۔显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе)۔ نمایاں طور پر تبدیل شدہ پروٹین کو سرخ رنگ میں نمایاں کیا گیا ہے (p <0.05 اور > آئنک طاقت میں 2 گنا فرق)۔متعلقہ پروٹین HEK293T-miniSOG کے لیے اہم ہیں لیکن HEK293T کے لیے اہم نہیں سبز رنگ میں دکھائے گئے ہیں۔b وین ڈایاگرام N-ٹرمینل اور C-ٹرمینل تعمیرات کے درمیان اوور لیپنگ پروٹین دکھا رہا ہے۔این ٹرمینل ٹیگ غیر معمولی طور پر پارکن کو چالو کر سکتے ہیں اور اس کے نتیجے میں زیادہ قابل شناخت پروٹین بن سکتے ہیں۔c وین ڈایاگرام PDPL اور AP-MS کے درمیان اوور لیپنگ پروٹین دکھا رہا ہے۔معروف انٹرایکٹرز درج ہیں، بشمول 18 میں سے 4 اوور لیپنگ پروٹین اور 159 میں سے 11 پروٹین خاص طور پر PDPL میں شناخت کیے گئے ہیں۔d LC-MS/MS کے ذریعے شناخت کیے گئے نمائندہ اہداف کی تصدیق مغربی بلاٹنگ کے ذریعے کی گئی۔e Ssu72 اور SNW1 کی شناخت غیر رجسٹرڈ پارکن سبسٹریٹس کے طور پر کی گئی۔یہ فلیگ ٹیگ شدہ پروٹین پلازمیڈز کو HEK293T اور HEK293T-Parkin-miniSOG میں تبدیل کیا گیا جس کے بعد مختلف ٹائم پوائنٹس پر CCCP علاج کیا گیا۔پارکن اوور ایکسپریشن لائن میں انحطاط زیادہ واضح تھا۔f proteasome inhibitor MG132 کا استعمال کرتے ہوئے، اس بات کی تصدیق کی گئی کہ Ssu72 اور SNW1 کے انحطاط کے عمل کو پروٹیزوم - ubiquitination کے ذریعے ثالثی کیا گیا ہے۔ان تجربات کو آزادانہ طور پر اسی طرح کے نتائج کے ساتھ کم از کم دو بار دہرایا گیا۔خام ڈیٹا خام ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔
خاص طور پر، PDPL کی طرف سے شناخت شدہ پروٹین میں پارکن بائنڈنگ پروٹین اور ان کے ذیلی ذخیرے شامل ہونے چاہئیں۔غیر رجسٹرڈ پارکن سبسٹریٹس کا پتہ لگانے کے لیے، ہم نے سات شناخت شدہ پروٹینز (PUF60، PSPC1، UCHL3، PPP1R8، CACYBP، Ssu72 اور SNW1) اور ٹرانسفیکٹڈ پلاسمیڈز کا انتخاب کیا تاکہ ان جینز کو عام HEK293T میں بے نقاب کیا جا سکے اور miniSOG-Parkin's 2CCCPed علاج کے ذریعے مستقل طور پر ظاہر کیا جا سکے۔Ssu72 اور SNW1 پروٹین کی سطح مستحکم miniSOG-Parkin لائن (تصویر 5e) میں نمایاں طور پر کم ہو گئی تھی۔CCCP کے ساتھ 12 گھنٹے تک علاج کرنے کے نتیجے میں دونوں ذیلی ذخائر میں انتہائی نمایاں کمی واقع ہوئی۔یہ جانچنے کے لیے کہ آیا Ssu72 اور SNW1 کے انحطاط کو پروٹیزوم یوبیکیٹینیشن کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے، پروٹیزوم انحبیٹر MG132 کو پروٹیزوم کی سرگرمی کو روکنے کے لیے شامل کیا گیا تھا، اور درحقیقت ہم نے پایا کہ ان کے انحطاط کے عمل کو روکا گیا تھا (تصویر 5f)۔اضافی نان سبسٹریٹ اہداف کی تصدیق پارکین انٹرایکٹرز کے طور پر کی گئی جو ویسٹرن بلوٹنگ (ضمنی شکل 10) کا استعمال کرتے ہوئے، جس نے LC-MS/MS کے ساتھ مسلسل نتائج دکھائے۔آخر میں، PDPL ورک فلو کا ٹارگٹ پروٹین ٹرانسفیکشن تصدیق کے ساتھ انضمام غیر رجسٹرڈ E3 ligase سبسٹریٹس کی شناخت کی اجازت دیتا ہے۔
ہم نے ایک مشترکہ قربت کا نشان لگانے والا پلیٹ فارم تیار کیا ہے جو آپ کو جگہ اور وقت کے ساتھ بات چیت کرنے والے POIs کی شناخت کرنے کی اجازت دیتا ہے۔یہ پلیٹ فارم منی ایس او جی فوٹو سنسیٹائزر پروٹین پر مبنی ہے، جو کہ صرف 12 کے ڈی اے ہے، جو کہ بالغ APEX2 انزائم (27 kDa) کے نصف سے بھی کم اور TurboID (35 kDa) کے ایک تہائی سائز کا ہے۔چھوٹے سائز کو چھوٹے پروٹین انٹراٹومس کا مطالعہ کرنے کے لیے ایپلی کیشنز کی حد کو بہت بڑھانا چاہیے۔اضافی فوٹو سینسائزرز کی مزید تلاش، چاہے جینیاتی طور پر انکوڈ شدہ پروٹینز ہوں یا چھوٹے مالیکیولز، سنگلٹ آکسیجن کی کوانٹم پیداوار بڑھانے اور اس نقطہ نظر کی حساسیت کو بڑھانے کے لیے ضروری ہے۔miniSOG کے موجودہ ورژن کے لیے، قربت کے نشانات کو چالو کرنے کے لیے نیلے رنگ کی روشنی کا استعمال کرتے ہوئے اعلی دنیاوی ریزولوشن حاصل کیا جا سکتا ہے۔اس کے علاوہ، طویل نمائش کے وقت نے سنگلٹ آکسیجن کا ایک بڑا "بادل" جاری کیا، جس کے نتیجے میں زیادہ ڈسٹل ہسٹائڈائن کی باقیات میں ترمیم، لیبلنگ کے رداس میں اضافہ، اور PDPL مقامی ریزولوشن کو ٹھیک کرنے کی صلاحیت۔ہم نے سگنل ٹو بیک گراؤنڈ تناسب کو بڑھانے کے لیے سات کیمیائی تحقیقات کا بھی تجربہ کیا اور اس نقطہ نظر کے پیچھے مالیکیولر میکانزم کی کھوج کی۔غیر جانبدارانہ کھلی تلاش کے ساتھ مل کر TOP-ABPP ورک فلو نے اس بات کی تصدیق کی کہ تبدیلیاں صرف ہسٹائڈائنز میں ہوئی ہیں اور ہسٹائڈائن میں اضافہ کے لیے کوئی مستقل مائیکرو ماحولیات نہیں دیکھی گئی، سوائے لوپ ریجن میں ہسٹائڈائنز کے لیے معتدل ترجیح کے۔
پی ڈی پی ایل کو پروٹوم کی خصوصیت اور کوریج کے ساتھ سب سیلولر پروٹوم کی خصوصیت کے لئے بھی استعمال کیا گیا ہے جو کم از کم دوسرے قربت کے لیبلنگ اور آرگنیل مخصوص کیمیائی تحقیقات کے طریقوں سے موازنہ ہے۔قربت کے نشانات کو بھی کامیابی کے ساتھ سطح، لیسوسومل، اور سیکروم سے وابستہ پروٹوم 46,47 کی خصوصیت کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔ہمیں یقین ہے کہ PDPL ان سب سیلولر آرگنیلز کے ساتھ ہم آہنگ ہوگا۔اس کے علاوہ، ہم نے PDPL کو سائٹوسولک پروٹین بائنڈنگ کے اہداف کی نشاندہی کرکے چیلنج کیا جو ان کی متحرک خصوصیات اور زیادہ وقتی تعاملات میں ملوث ہونے کی وجہ سے جھلی کے پابند پروٹین سے زیادہ پیچیدہ ہیں۔PDPL دو پروٹینوں پر لاگو کیا گیا تھا، ٹرانسکریشنل کوایکٹیویٹر BRD4 اور بیماری سے وابستہ ligase E3 Parkin۔یہ دونوں پروٹین نہ صرف ان کے بنیادی حیاتیاتی افعال کے لیے منتخب کیے گئے تھے بلکہ ان کی طبی مطابقت اور علاج کی صلاحیت کے لیے بھی منتخب کیے گئے تھے۔ان دو POIs کے لیے، معروف پابند شراکت داروں کے ساتھ ساتھ غیر رجسٹرڈ اہداف کی نشاندہی کی گئی۔خاص طور پر، مرحلہ علیحدگی سے وابستہ پروٹین SFPQ کی تصدیق co-IP کے ذریعے کی گئی تھی، جو ایک نئے طریقہ کار کی نشاندہی کر سکتی ہے جس کے ذریعے BRD4 (مختصر isoform) LLPS کو منظم کرتا ہے۔ایک ہی وقت میں، ہم سمجھتے ہیں کہ پارکن سبسٹریٹس کی شناخت ایک ایسا منظر نامہ ہے جس میں بالواسطہ چپکنے والی چیزوں کی شناخت ضروری ہے۔ہم نے پارکن کے دو نامعلوم ذیلی ذخیروں کی نشاندہی کی اور ہر جگہ پروٹیزوم پاتھ وے کے ساتھ ان کے انحطاط کی تصدیق کی۔حال ہی میں، ایک میکانزم پر مبنی ٹریپنگ حکمت عملی تیار کی گئی ہے تاکہ ہائیڈرولیس سبسٹریٹس کو انزائمز کے ساتھ پھنسایا جا سکے۔اگرچہ یہ ایک بہت ہی طاقتور طریقہ ہے، لیکن یہ بڑے کمپلیکس کی تشکیل میں شامل ذیلی ذخیرے کے تجزیہ کے لیے موزوں نہیں ہے اور اس کے لیے انزائم اور سبسٹریٹ کے درمیان ہم آہنگی بندھن کی تشکیل کی ضرورت ہوتی ہے۔ہم توقع کرتے ہیں کہ پی ڈی پی ایل کو دوسرے پروٹین کمپلیکس اور انزائم فیملیز، جیسے ڈیبیوکیٹینیس اور میٹالوپروٹیز فیملیز کا مطالعہ کرنے کے لیے بڑھایا جا سکتا ہے۔
منی ایس او جی کی ایک نئی شکل، جسے ایس او پی پی 3 کہا جاتا ہے، سنگلٹ آکسیجن کی بہتر پیداوار کے ساتھ تیار کیا گیا ہے۔ہم نے miniSOG کا SOPP3 سے موازنہ کیا اور مارکنگ کی بہتر کارکردگی پائی، حالانکہ سگنل ٹو شور کا تناسب کوئی تبدیلی نہیں رہا (ضمیمہ تصویر 11)۔ہم نے قیاس کیا کہ ایس او پی پی 3 کی اصلاح (مثلاً ہدایت شدہ ارتقاء کے ذریعے) زیادہ موثر فوٹو سنسیٹائزر پروٹینز کا باعث بنے گی جس کے لیے روشنی کا کم وقت درکار ہوتا ہے اور اس طرح زیادہ متحرک سیلولر عمل کو پکڑنے کی اجازت ملتی ہے۔خاص طور پر، PDPL کا موجودہ ورژن سیلولر ماحول تک محدود ہے کیونکہ اسے نیلی روشنی کی روشنی کی ضرورت ہوتی ہے اور یہ گہرے ٹشوز میں داخل نہیں ہو سکتا۔یہ خصوصیت جانوروں کے ماڈل کے مطالعے میں اس کے استعمال کو روکتی ہے۔تاہم، PDPL کے ساتھ optogenetics کا امتزاج جانوروں کی تحقیق کا موقع فراہم کر سکتا ہے، خاص طور پر دماغ میں۔اس کے علاوہ، دیگر انجینئرڈ انفراریڈ فوٹو سینسائزر بھی اس حد کو ہٹا دیتے ہیں۔اس علاقے میں فی الحال تحقیق جاری ہے۔
HEK293T سیل لائن ATCC (CRL-3216) سے حاصل کی گئی تھی۔سیل لائن نے مائکوپلاسما انفیکشن کے لیے منفی تجربہ کیا اور اسے DMEM (Thermo, #C11995500BT) میں 10% فیٹل بوائین سیرم (FBS, Vistech, #SE100-B) اور 1% پینسلن/سٹریپٹومائسن (Hyclone, #SV3) کے ساتھ مکمل کیا گیا۔میں اضافہ ہوا
3-Aminophenylene (نمونہ 3) اور (4-ethynylphenyl) methanamine (sample 4) Bidepharm سے خریدے گئے تھے۔پروپیلامین (تحقیقات 2) انرجی کیمیکلز سے خریدی گئی تھی۔N-(2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (probe 1) کو شائع شدہ طریقوں کے مطابق ترکیب کیا گیا تھا۔
ضمنی جدول 1 اس مطالعے میں استعمال ہونے والی جینیاتی تعمیرات کی فہرست دیتا ہے۔miniSOG اور KillerRed کی ترتیب کو P. Zou (Peking University) کے گفٹ پلاسمڈ سے کلون کیا گیا تھا۔مائٹوکونڈریل میٹرکس کو نشانہ بنانے کی ترتیب COX4 کے 23 N-ٹرمینل امینو ایسڈ سے اخذ کی گئی تھی اور گبسن اسمبلی (Beyotime, #D7010S) کا استعمال کرتے ہوئے اشارہ کردہ ویکٹرز میں کلون کیا گیا تھا۔اینڈوپلاسمک ریٹیکولم کی جھلی اور نیوکلئس کو نشانہ بنانے کے لیے، SEC61B انسانی DNA (NM_006808.3) (NEB، #M0491L) HEK293T خلیات کی cDNA لائبریری سے PCR کے ذریعے بڑھایا گیا، اور H2B DNA (D. Lin, Ba Shenzhen کے ذریعے عطیہ کردہ) اور کلون، جیسا کہ اوپر بتایا گیا ہے۔جب تک کہ دوسری صورت میں اشارہ نہ کیا جائے، منتقلی اور مستحکم سیل لائنوں کی تعمیر کے لیے استعمال ہونے والے دیگر پروٹین جینز کو HEK293T سیل cDNA لائبریری سے PCR بڑھا دیا گیا تھا۔G3S (GGGS) اور G4S (GGGGS) بیت پروٹین اور منی ایس او جی کے درمیان ربط کے طور پر استعمال ہوتے تھے۔ان فیوژن تعمیرات میں ایک V5 ایپیٹوپ ٹیگ (GKPIPNPLLGLDST) شامل کیا گیا تھا۔ستنداریوں میں اظہار اور ایک مستحکم سیل لائن قائم کرنے کے لیے، miniSOG فیوژن کنسٹرکٹ کو pLX304 lentiviral vector میں subcloned کیا گیا تھا۔بیکٹیریل اظہار کے لیے، miniSOG کو C-ٹرمنس پر 6xHis کے لیبل والے pET21a ویکٹر میں کلون کیا گیا تھا۔
HEK293T خلیات کو چھ کنویں پلیٹوں میں 2.0 x 105 خلیات فی کنواں پر سیڈ کیا گیا تھا اور 24 گھنٹے بعد ریکومبیننٹ لینٹیو وائرل پلازمیڈز (2.4 μg pLX304) اور وائرل پیکیجنگ پلازمیڈ (1.5 μg psPAX2 اور 1.2 LiBpog08 کے ساتھ p.2 μg) کے ساتھ منتقل کیا گیا تھا۔ , #C0533) تقریباً 80% فیوژن۔راتوں رات منتقلی کے بعد، میڈیم کو تبدیل کر دیا گیا اور مزید 24 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔وائرس کا مجموعہ 24، 48 اور 72 گھنٹے کے بعد کیا گیا۔ٹارگٹ سیل لائنوں کے انفیکشن سے پہلے، وائرل میڈیم کو 0.8 μm فلٹر (Merck، #millex-GP) کے ذریعے فلٹر کیا گیا تھا اور پولی برین (Solarbio، #H8761) کو 8 μg/ml کے ارتکاز میں شامل کیا گیا تھا۔24 گھنٹوں کے بعد، خلیوں کو میڈیم کو تبدیل کرکے بحال کرنے کی اجازت دی گئی۔خلیات کو 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) کا استعمال کرتے ہوئے پہلے تین حصئوں کے لیے کم سخت انتخاب کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔پھر اگلے تین حصئوں کے لیے 20 μg/ml کو زیادہ سخت طریقہ کار کے طور پر استعمال کیا۔
سیلوں کو 12 کنویں کے چیمبرز (Ibidi، #81201) میں تقریباً 20,000 سیل فی کنویں کی کثافت پر سیڈ کیا گیا تھا۔HEK293T خلیات کے چپکنے کو بہتر بنانے کے لیے، 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) کو 37°C پر فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS, Sangon, #B640435) میں ملا کر ڈالیں۔چیمبروں کو 1 گھنٹہ کے لئے پریٹریٹ کیا گیا اور پھر پی بی ایس کے ساتھ ہٹا دیا گیا۔24 گھنٹے کے بعد، خلیوں کو پی بی ایس کے ساتھ ایک بار دھویا گیا، 1 ایم ایم پروب 3 کے ساتھ تازہ ہینکس کے متوازن نمک کے محلول (HBSS، Gibco، #14025092) میں 37 ° C پر 1 گھنٹہ کے لیے لگایا گیا، اور پھر نیلے رنگ کی LED (460 nm) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ )۔کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لئے شعاع ریزی کی گئی۔اس کے بعد، خلیات کو پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھویا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ کے لیے پی بی ایس (سنگون، #E672002) میں 4% فارملڈہائیڈ کے ساتھ فکس کیا گیا۔پی بی ایس کے ساتھ تین بار دھو کر مقررہ خلیوں سے اضافی فارملڈہائڈ کو ہٹا دیا گیا تھا۔اس کے بعد خلیوں کو PBS میں 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) کے ساتھ پارمیبلائز کیا گیا اور PBS کے ساتھ 3 بار دھویا گیا۔پھر چیمبر کو ہٹا دیں اور ہر ایک نمونے میں 25 µl کلک ری ایکشن مرکب شامل کریں جس میں 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720)، 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008)، 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) اور 0.5 ملی گرام/ملی لیٹر سوڈیم ایسکوربیٹ (علاد، نمبر S105024) اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔اچانک رد عمل کے بعد، خلیات کو PBS کے ساتھ چھ بار دھویا گیا جس میں 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) تھا اور پھر کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ کے لیے PBST میں 5% BSA (Abcone, #B24726) کے ساتھ بلاک کر دیا گیا۔
اجتماعی امیونوسٹیننگ کے لیے، خلیات کو اشارہ شدہ حالات کے مطابق بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا: ماؤس اینٹی وی 5 ٹیگ ایم اے بی (1:500، سی ایس ٹی، #80076)، خرگوش اینٹی ایچ ایس پی 60 ایم اے بی (1:1000)، ABclonal، #A0564) خرگوش پولی کلونل اینٹی کیلنیکسن اینٹی باڈی (1:500، Abcam، #ab22595) یا خرگوش اینٹی لامین A/C مونوکلونل اینٹی باڈی (1:500؛ CST، #2032) رات بھر 4 °C پر۔PBST کے ساتھ 3 بار دھونے کے بعد، خلیات کو ثانوی اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا: بکری اینٹی خرگوش Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) 1:1000، بکری اینٹی ماؤس Alexa Fluor 594 (CST, #8889) 1:100 پتلا ہوا۔dilution کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک پتلا کریں۔اس کے بعد سیلز کو پی بی ایس ٹی کے ساتھ 3 بار دھویا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے پی بی ایس میں ڈی اے پی آئی (تھرمو، #D1306) کے ساتھ کاؤنٹر اسٹین کیا گیا۔پی بی ایس کے ساتھ 3 دھونے کے بعد، امیجنگ کے لیے پی بی ایس میں سیلز کو 50٪ گلیسرول (سنگون، #A600232) میں سیل کر دیا گیا۔امیونو فلوروسینٹ تصاویر ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal microscope اور ZNE 3.5 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی گئیں۔
سنگلٹ آکسیجن فلوروسینٹ امیجنگ کے لیے، Hanks HEPES بفر (DOJINDO، #MT05) میں 100 nM Si-DMA شامل کرنے سے پہلے ہینکس HEPES بفر کے ساتھ خلیات کو دو بار دھویا گیا۔روشنی کی نمائش کے بعد، خلیات کو CO2 انکیوبیٹر میں 37 ° C پر 45 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔اس کے بعد سیلوں کو ہینکس کے HEPES بفر سے دو بار دھویا گیا اور ہینکس کے HEPES بفر میں Hoechst کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لئے کاؤنٹر اسٹین کیا گیا اور ZEISS LSM 900 کنفوکل مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا۔, #M36008) کیلشیم اور میگنیشیم پر مشتمل HBSS بفر میں۔روشنی یا doxorubicin (MCE, #HY-15142A) کے سامنے آنے کے بعد، خلیات کو CO2 انکیوبیٹر میں 37° C. پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا، HBSS بفر سے دو بار دھویا گیا، اور HBSS بفر میں Hoechst کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر انکیوبیٹ کیا گیا۔منٹDoxorubicin کو ایک مثبت تحقیقاتی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا جہاں HBSS میں 20 μM doxorubicin کے ساتھ خلیات کا علاج کیا گیا تھا جس میں 30 منٹ تک 1% BSA شامل تھا۔زیس ایل ایس ایم 900 کنفوکل مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے امیونو فلوروسینٹ تصاویر حاصل کی گئیں۔
HEK293T خلیات جو mito-miniSOG کو مستحکم طور پر ظاہر کرتے ہیں 15 سینٹی میٹر کے برتنوں میں تقریباً 30٪ کی کثافت پر سیڈ کیے گئے تھے۔48 گھنٹوں کے بعد، جب ~ 80% سنگم تک پہنچ گیا، سیلز کو ایک بار پی بی ایس کے ساتھ دھویا گیا، تازہ HBSS بفر میں 1 ایم ایم پروب 3 کے ساتھ 37 ڈگری سینٹی گریڈ پر 1 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا اور پھر کمرے میں 10 منٹ کے لیے نیلے رنگ کی ایل ای ڈی سے روشن کیا گیا۔ درجہ حرارت.اس کے بعد، خلیوں کو پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھویا گیا، EDTA فری پروٹیز انحیبیٹرز (MCE، #HY-K0011) پر مشتمل برف کے ٹھنڈے پی بی ایس بفر میں سکریپ اور دوبارہ معطل کیا گیا۔سیلز کو 1 منٹ (35% طول و عرض پر 1 سیکنڈ آن اور 1 سیکنڈ آف) کے لیے نوک کو سونیک کر کے لیس کیا گیا تھا۔نتیجے میں مرکب کو 15,871 xg پر 10 منٹ کے لیے 4 ° C پر ملبے کو ہٹانے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا تھا، اور BCA پروٹین پرکھ کٹ (Beyotime، #P0009) کا استعمال کرتے ہوئے سپرنٹنٹ ارتکاز کو 4 mg/mL میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔مندرجہ بالا 1 ملی لیٹر کو 0.1 ایم ایم فوٹوڈیگریڈ ایبل بایوٹین ایزائیڈ (کنفلور، #BBBD-14)، 1 mM TCEP (Sangon, #A600974)، 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437)، اور 1 mM Cuubator کے ساتھ ملا دیں۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے تک گردش کریں۔اسنیپ ری ایکشن کے بعد، مرکب کو 10 ملی لیٹر شیشے کی شیشی میں پہلے سے ملا ہوا محلول (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) میں شامل کریں۔نمونوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے 4500 گرام پر ملایا گیا اور سینٹرفیوج کیا گیا۔نچلے اور اوپری محلولوں کو ضائع کر دیا گیا، 1 ملی لیٹر میتھانول کے ساتھ پرسیپیٹیٹ کو دو بار دھویا گیا اور 15871×g پر 4 ° C پر 5 منٹ کے لیے سینٹری فیوج کیا گیا۔25 ملی میٹر امونیم بائک کاربونیٹ (ABC، علاء، نمبر A110539) میں 1 ملی لیٹر 8 ایم یوریا (علادین، نمبر U111902) شامل کریں۔نمونوں کو 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) کے ساتھ 40 منٹ کے لیے 55 ° C پر دوبارہ تشکیل دیا گیا جس کے بعد اندھیرے میں کمرے کے درجہ حرارت پر 15 ملی میٹر تازہ iodoacetamide (Sangon, #A600539) کا اضافہ کیا گیا۔30 منٹ کے اندر الکیلیشن۔.ردعمل کو روکنے کے لیے ایک اضافی 5 ایم ایم ڈیتھیوتھریٹول شامل کیا گیا۔1 ملی لیٹر پی بی ایس کے ساتھ 3 بار دھو کر ہر نمونے کے لیے تقریباً 100 µl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) تیار کریں۔مندرجہ بالا پروٹوم محلول کو 5 ملی لیٹر پی بی ایس کے ساتھ پتلا کیا گیا تھا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 4 گھنٹے کے لئے پہلے سے دھوئے ہوئے نیوٹراویڈن ایگروز موتیوں کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔اس کے بعد موتیوں کو 5 ملی لیٹر پی بی ایس کے ساتھ 3 بار دھویا گیا جس میں 0.2٪ ایس ڈی ایس (سنگون، #A600485) تھا، 3 بار 5 ملی لیٹر پی بی ایس جس میں 1M یوریا تھا، اور 3 بار 5 ملی لیٹر ddH2O کے ساتھ دھویا گیا۔اس کے بعد موتیوں کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے کاٹا گیا اور 200 μl 25 mM ABC میں دوبارہ معطل کیا گیا جس میں 1 M یوریا، 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) اور 20 ng/μl ٹرپسن (پرومیگا، #V5280) شامل ہیں۔رات بھر 37°C پر گردش کے ساتھ ٹرپسنائز کریں۔فارمک ایسڈ (تھرمو، # A117-50) شامل کرکے رد عمل کو روک دیا گیا جب تک کہ pH 2-3 تک نہ پہنچ جائے۔موتیوں کو 1 ملی لیٹر پی بی ایس کے ساتھ 3 بار دھویا گیا جس میں 0.2٪ ایس ڈی ایس ہے، 3 بار 1 ملی لیٹر پی بی ایس جس میں 1 ایم یوریا ہے، اور پھر 3 بار 1 ملی لیٹر آست پانی سے دھویا گیا۔ترمیم شدہ پیپٹائڈس کو لائٹ لیسس (365 nm) کے ذریعہ 90 منٹ کے لئے 200 μl 70٪ MeOH کا استعمال کرتے ہوئے جاری کیا گیا تھا۔سینٹرفیوگریشن کے بعد، سپرنٹنٹنٹ جمع کیا گیا تھا.اس کے بعد موتیوں کو 70% MeOH کے 100 μl کے ساتھ ایک بار دھویا گیا اور سپرنٹنٹس کو جمع کیا گیا۔نمونے اسپیڈ ویک ویکیوم کنسنٹریٹر میں خشک کیے گئے تھے اور تجزیہ تک -20 ° C پر محفوظ کیے گئے تھے۔
سنگلٹ آکسیجن موڈیفائیڈ پیپٹائڈس کی شناخت اور مقدار درست کرنے کے لیے، نمونوں کو 0.1% فارمک ایسڈ میں دوبارہ تحلیل کیا گیا اور 1 μg پیپٹائڈس کا تجزیہ ایک Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ماس اسپیکٹومیٹر کے ذریعے کیا گیا جو کہ وینڈر سافٹ ویئر43 سے Tune اور Xcalibur سے نینو ESI سورس سے لیس تھا۔نمونے 75 µm × 15 سینٹی میٹر اندرونی طور پر پیک کیپلیری کالم پر 3 µm C18 مواد (ReproSil-pur, #r13.b9.) کے ساتھ الگ کیے گئے تھے اور EASY-nLC 1200 UHPLC سسٹم (تھرمو) سے منسلک تھے۔پیپٹائڈس کو لکیری 95 منٹ گریڈینٹ کرومیٹوگرافی کے ذریعے 8% سالوینٹ B سے 50% سالوینٹ B (پانی میں A = 0.1% فارمک ایسڈ، 80% acetonitrile میں B = 0.1% فارمک ایسڈ) کے ذریعے الگ کیا گیا، پھر لکیری طور پر بڑھ کر 98% B منٹ ہو گیا۔ 300 nl/منٹ کی بہاؤ کی شرح پر 6 منٹ میں۔Orbitrap Fusion Lumos ڈیٹا کے لحاظ سے مکمل MS اسکین اور MS2 اسکین کے درمیان باری باری ڈیٹا اکٹھا کرتا ہے۔سپٹرنگ وولٹیج 2.1 kV پر سیٹ کیا گیا تھا اور آئن ٹرانسپورٹ کیپلیری کا درجہ حرارت 320 ° C تھا۔MS سپیکٹرا (350-2000 m/z) کو 120,000، AGC 4 × 105، اور 150 ms کے زیادہ سے زیادہ ان پٹ ٹائم کے ساتھ جمع کیا گیا۔ہر ایک مکمل اسکین میں 10 سب سے عام ملٹی پلائی چارج شدہ پیشگی HCD کا استعمال کرتے ہوئے 30% کی عام ٹکراؤ توانائی، 1.6 m/z کی کواڈروپول آئسولیشن ونڈو، اور 30,000 کی ریزولوشن سیٹنگ کے ساتھ ٹکڑے ٹکڑے کیے گئے تھے۔5×104 اور زیادہ سے زیادہ ان پٹ ٹائم 150 ms کا استعمال کرتے ہوئے ٹینڈم ماس اسپیکٹومیٹری کے لیے ایک AGC ہدف۔متحرک رعایت 30 سیکنڈ پر سیٹ ہے۔ غیر تفویض کردہ آئنوں یا 1+ اور >7+ کے چارج والے MS/MS کے لیے مسترد کر دیے گئے۔ غیر تفویض کردہ آئنوں یا 1+ اور >7+ کے چارج والے MS/MS کے لیے مسترد کر دیے گئے۔ Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ اور >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ اور >7+ کے چارج والے غیر تفویض کردہ آئنوں یا آئنوں کو MS/MS کے لیے مسترد کر دیا گیا تھا۔未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS۔未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS۔ Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ اور >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS کے لیے 1+ اور >7+ کے چارجز کے ساتھ غیر متعینہ آئنوں یا آئنوں کو مسترد کر دیا گیا۔
خام ڈیٹا کو MSFragger پر مبنی FragPipe کمپیوٹنگ پلیٹ فارم کا استعمال کرتے ہوئے پروسیس کیا جاتا ہے۔بڑے پیمانے پر تعصبات اور متعلقہ امینو ایسڈز کا تعین اوپن سرچ الگورتھم کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا جس کی پیشگی ماس رواداری -150 سے 500 Da ہے۔اس کے بعد ترمیم شدہ پیپٹائڈس کی شناخت PD میں +229.0964 اور +247.1069 Da (Proteome Discoverer 2.5، Thermo) کے بڑے پیمانے پر حاصل کرنے کے ساتھ ہسٹائڈائن ترمیم کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔
فیوزڈ منی ایس او جی جین کو مستحکم طور پر ظاہر کرنے والے خلیوں کو 6 سینٹی میٹر کے برتنوں میں چڑھایا گیا تھا۔~80% سنگم تک پہنچنے پر، خلیات کو HBSS (Gibco, #14025092) کے ساتھ ایک بار دھویا گیا، پھر HBSS میں کیمیائی تحقیقات کے ساتھ 37°C پر 1 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا اور نیلی روشنی سے روشن کیا گیا۔کمرے کے درجہ حرارت پر 20 منٹ کے لیے 10W LED۔اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ PDPL میں کس قسم کی ری ایکٹیو آکسیجن کی نوع شامل ہے، 0.5 mM وٹامن C (MCE, #HY-B0166)، 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445)، D2O (Sigma, #7789-20-0)، 100 ایم ایم مینیٹول (انرجی کیمیکل، #69-65-8)، 100 μM H2O2، 10 mM NaN3 کو سپلیمنٹس کے طور پر خلیوں میں شامل کیا گیا۔ٹھنڈے پی بی ایس سے دھونے کے بعد، خلیوں کو کھرچ دیا گیا، 1.5 ملی لیٹر سینٹری فیوج ٹیوبوں میں جمع کیا گیا، اور EDTA کے بغیر 1x پروٹیز انحیبیٹر کے ساتھ PBS کے 200 μl میں 1 منٹ کے لیے ٹپ کے ساتھ سونیکیٹ کیا گیا (1 s اور 1 s بغیر، طول و عرض 35%)۔نتیجے میں مرکب کو 10 منٹ کے لیے 4 ° C پر 15,871 × g پر سینٹرفیوج کیا گیا اور BCA پروٹین پرکھ کٹ کا استعمال کرتے ہوئے سپرنٹنٹ ارتکاز کو 1 mg/mL میں ایڈجسٹ کیا گیا۔تقریباً 50 μl مندرجہ بالا lysate کو 0.1 mM روڈامین azide (Aladdin, no. T131368)، 1 mM TCEP، 0.1 mM TBTA ligand، اور 1 mM CuSO4 کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے نیچے سے اوپر کی طرف گردش کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔کلک کے رد عمل کے بعد، نمونوں میں 250 μl پری ٹھنڈا ایسٹون شامل کرکے، 20 منٹ کے لیے -20 ° C پر انکیوبٹنگ اور 4 ° C پر 10 منٹ کے لیے 6010×g پر سینٹرفیوگ کرکے ایسٹون کے ساتھ بارش کی گئی۔گولی جمع کریں اور 50 µl 1x Laemmli کے بفر میں 95 ° C پر 10 منٹ کے لیے ابالیں۔اس کے بعد SDS-PAGE لمبی جیلوں پر نمونوں کا تجزیہ کیا گیا اور امیج لیب ٹچ سافٹ ویئر کے ساتھ Bio-rad ChemiDoc MP ٹچ امیجنگ سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا۔
Recombinant miniSOG-6xHis پروٹین کا اظہار اور تطہیر جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا۔مختصراً، E. coli BL21(DE3) خلیات (TransGen, #CD701-02) کو pET21a-miniSOG-6xHis کے ساتھ تبدیل کیا گیا تھا اور پروٹین کا اظہار 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168) کے ساتھ ہوا تھا۔سیل لیسز کے بعد، پروٹین کو Ni-NTA ایگرز موتیوں (MCE، نمبر 70666) کا استعمال کرتے ہوئے پاک کیا گیا، PBS کے خلاف ڈائلائز کیا گیا، اور -80°C پر ذخیرہ کیا گیا۔
اینٹی باڈی پر مبنی ان وٹرو لیبل قربت پرکھ کے لیے، PBS میں 100 μM پیوریفائیڈ miniSOG، 1 mM پروب 3، اور 1 μg اینٹی لیبل ماؤس مونوکلونل اینٹی باڈی (TransGen, #HT501-01) کو پی بی ایس میں ملا دیں۔.رد عمل کے مرکب کو کمرے کے درجہ حرارت پر 0، 2، 5، 10، اور 20 منٹ کے لیے نیلی ایل ای ڈی لائٹ سے شعاع کیا گیا تھا۔اس مرکب کو 0.1 ایم ایم بایوٹین-پی ای جی 3-آزائڈ (علاد، #B122225)، 1 ایم ایم ٹی سی ای پی، 0.1 ایم ایم ٹی بی ٹی اے لیگنڈ، اور 1 ایم ایم CuSO4 کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے اوپر کی طرف موشن شیکر پر لگایا گیا تھا۔فوری ردعمل کے بعد، 4x لیمملی کے بفر کو براہ راست مرکب میں شامل کریں اور 95 ° C پر 10 منٹ تک ابالیں۔نمونوں کا تجزیہ SDS-PAGE جیلوں پر کیا گیا اور اسٹریپٹاویڈن-HRP (1:1000، سولاربیو، #SE068) کے ساتھ مغربی بلاٹنگ کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔
سی ٹرمینل امیڈیشن (LHDALDAK-CONH2) کے ساتھ ہسٹائڈائن پر مشتمل مصنوعی پیپٹائڈ کا استعمال قریبی پیپٹائڈ پر مبنی ان وٹرو لیبلنگ کا تجزیہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔اس پرکھ میں، 100 μM پیوریفائیڈ miniSOG، 10 mM پروب 3 اور 2 μg/ml مصنوعی پیپٹائڈ PBS میں 50 μl کے کل رد عمل کے حجم میں ملایا گیا تھا۔رد عمل کے مرکب کو کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے نیلی ایل ای ڈی لائٹ سے شعاع کیا گیا تھا۔نمونے کے ایک مائیکرو لیٹر کا تجزیہ LC-MS سسٹم (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight MassLynx سپیکٹرم تجزیہ سافٹ ویئر کے ساتھ ماس سپیکٹرومیٹر) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔
HEK293T خلیات جو miniSOG فیوژن جین کو مستحکم طور پر ظاہر کرتے ہیں ان کو مختلف آرگنیل لوکلائزیشن (Mito، ER، Nucleus) والی لائنوں کے لیے 10 سینٹی میٹر ڈشز میں اور Parkin-miniSOG اور BRD4-miniSOG لائنوں کے لیے 15 سینٹی میٹر ڈشز میں سیڈ کیا گیا تھا۔~90% سنگم تک پہنچنے پر، خلیات کو HBSS کے ساتھ ایک بار دھویا گیا، پھر HBSS میں 37 ڈگری سینٹی گریڈ پر 1 گھنٹے کے لیے پروب 3 کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 10 ڈبلیو نیلی ایل ای ڈی سے روشن کیا گیا۔پارکن کی نان کنٹیکٹ لیبلنگ کے لیے، HBSS میں پروب 3 کے ساتھ 10 µM پروٹون کاربونیل سائینائیڈ کیریئر m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) 37°C پر 1 گھنٹے کے لیے شامل کیا گیا۔سیل لیسز، کلک کیمسٹری، کمی اور الکائیلیشن کے اقدامات وہی تھے جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، سوائے اس کے کہ 2 ملی گرام لیسیٹ شامل کیا گیا تھا اور بائیوٹن پی ای جی 3 ایزائیڈ کو فوٹوڈیگریڈیبل بائیوٹن ایزائیڈ کے بجائے کلک ری ایکشن میں استعمال کیا گیا تھا۔افزودگی کے بعد، موتیوں کو 5 ملی لیٹر پی بی ایس کے ساتھ 3 بار دھویا گیا جس میں 0.2٪ ایس ڈی ایس ہے، 3 بار 5 ملی لیٹر پی بی ایس جس میں 1 ایم یوریا ہے، اور 3 بار 5 ملی لیٹر پی بی ایس کے ساتھ۔اس کے بعد، 2 µg ٹرپسن 300 µl 25 mM ABC میں شامل کیا گیا جس میں 1 M یوریا موجود ہے تاکہ پروٹین کو 37 ° C پر رات بھر صاف کیا جاسکے۔فارمک ایسڈ شامل کرکے رد عمل کو روک دیا گیا جب تک کہ پی ایچ 2-3 تک نہ پہنچ جائے۔موتیوں پر ٹرپسنائزیشن کے بعد، پیپٹائڈ محلول کو SOLAµ HRP کالم (تھرمو، #60209-001) کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا گیا اور اسپیڈ ویک ویکیوم کنسنٹریٹر میں خشک کیا گیا۔پیپٹائڈس کو 0.1% فارمک ایسڈ میں دوبارہ تحلیل کیا گیا اور اوپر بیان کردہ نینو-ESI سورس سے لیس Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ماس اسپیکٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے 500 ng پیپٹائڈس کا تجزیہ کیا گیا۔کمرشل RP-HPLC پری کالم (75 μm x 2 سینٹی میٹر) (تھرمو، نمبر 164946) اور تجزیاتی RP-HPLC کالم (75 μm x 25 سینٹی میٹر) (تھرمو، نمبر 164941) پر پیپٹائڈس کو الگ کیا گیا تھا، دونوں 2 μm سے بھرے ہوئے تھے۔60 منٹ میں 8% سے 35% ACN تک گریڈینٹ، پھر 300 Nl/منٹ کی بہاؤ کی شرح سے 6 منٹ میں 98% B تک لکیری طور پر بڑھ گیا۔MS سپیکٹرا (350-1500 m/z) کو 60,000، AGC 4 × 105، اور زیادہ سے زیادہ ان پٹ ٹائم 50 ms کے ساتھ جمع کیا گیا تھا۔منتخب آئنوں کو ترتیب وار HCD کے ذریعے 3 s سائیکلوں میں 30% کی تصادم کی معمول کی توانائی، 1.6 m/z کی کواڈروپول آئسولیشن ونڈو، اور 15000 کی ریزولوشن کے ساتھ تقسیم کیا گیا۔ 5 × 104 ٹینڈم ماس سپیکٹرو میٹر AGC ہدف اور زیادہ سے زیادہ انجیکشن ٹائم 22 ایم ایس کا استعمال کیا گیا۔متحرک اخراج 45 سیکنڈز پر سیٹ ہے۔ غیر تفویض کردہ آئنوں یا 1+ اور >7+ کے چارج والے MS/MS کے لیے مسترد کر دیے گئے۔ غیر تفویض کردہ آئنوں یا 1+ اور >7+ کے چارج والے MS/MS کے لیے مسترد کر دیے گئے۔ Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ اور >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ اور >7+ کے چارج والے غیر تفویض کردہ آئنوں یا آئنوں کو MS/MS کے لیے مسترد کر دیا گیا تھا۔未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS۔未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS۔ Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ اور >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS کے لیے 1+ اور >7+ کے چارجز کے ساتھ غیر متعینہ آئنوں یا آئنوں کو مسترد کر دیا گیا۔
NeutrAvidin موتیوں کی افزودگی تک نمونے کی تیاری کے اقدامات وہی تھے جو اوپر بیان کردہ LC-MS/MS تجزیہ میں تھے۔تقریباً 50 μg lysate کو لوڈنگ کنٹرول کے لیے ان پٹ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا اور 2 mg lysate کو کلک کے رد عمل کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔نیوٹراویڈن کے ساتھ افزودگی اور دھونے کے بعد، پابند پروٹینوں کو 50 μl لیمملی کے بفر کو ایگروز رال موتیوں میں شامل کرکے اور 95 ° C. پر 5 منٹ تک ابال کر ختم کیا گیا۔کنٹرول لوڈ ان پٹ اور مالا سے افزودہ نمونوں کا تجزیہ SDS-PAGE کے ذریعے کیا گیا اور معیاری مغربی بلٹ طریقوں کے ذریعے PVDF جھلیوں (ملی پور، #ISEQ00010) میں منتقل کیا گیا۔جھلیوں کو TBS میں 5% سکم دودھ (Sangon, #A600669) کے ساتھ بلاک کیا گیا تھا جس میں 0.1% tween-20 (TBST) شامل تھے اور پرائمری اور سیکنڈری اینٹی باڈیز کے ساتھ ترتیب وار انکیوبیٹ کیے گئے تھے۔پرائمری اینٹی باڈیز کو ٹی بی ایس ٹی میں 5% سکم دودھ میں 1:1000 پر گھٹا دیا گیا اور رات بھر 4°C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ثانوی اینٹی باڈیز کا استعمال 1:5000 کے تناسب میں کیا گیا تھا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔جھلیوں کو کیمیڈوک ایم پی امیجنگ سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے کیمیلومینیسینس کے ذریعہ تصور کیا گیا تھا۔اعداد و شمار میں دھبوں اور جیلوں کے تمام غیر کٹے ہوئے اسکینوں کو خام ڈیٹا کے طور پر پیش کیا گیا ہے۔
اس مطالعے میں استعمال ہونے والی بنیادی اینٹی باڈیز میں خرگوش اینٹی ایس ایف پی کیو مونوکلونل اینٹی باڈی (CST، نمبر 71992)، خرگوش اینٹی FUS مونوکلونل اینٹی باڈی (CST، نمبر 67840)، خرگوش اینٹی NSUN2 پولی کلونل اینٹی باڈی (پروٹینٹیک، نمبر 20854-1-) شامل ہیں۔ AP)، خرگوش اینٹی mSin3A پولی کلونل اینٹی باڈی (Abcam, #ab3479)، ماؤس اینٹی ٹیگ مونوکلونل اینٹی باڈی (TransGen, #HT201-02), ماؤس اینٹی β-ایکٹین مونوکلونل اینٹی باڈی (TransGen, #HC201-01)، خرگوش اینٹی -CDK2 مونوکلونل اینٹی باڈی (ABclonal, #A0094)، خرگوش مونوکلونل اینٹی باڈی سے CTBP1 (ABclonal, #A11600)، خرگوش پولی کلونل اینٹی باڈی سے DUT (ABclonal، #A2901)، خرگوش پولی کلونل اینٹی باڈی سے PSMC4 (ABclonal، #A2505)، خرگوش پولی کلونل اینٹی باڈی DNAJB1 پولی کلونل اینٹی باڈی (ABclonal, #A5504)۔یہ اینٹی باڈیز TBST میں 5% سکم دودھ میں 1:1000 کی کمی پر استعمال کی گئیں۔اس تحقیق میں استعمال ہونے والی ثانوی اینٹی باڈیز میں اینٹی خرگوش IgG (TransGen, #HS101-01)، اینٹی ماؤس IgG (TransGen, #HS201-01) 1:5000 کی کمی پر شامل تھے۔
مزید تفتیش کرنے کے لیے کہ آیا BRD4 SFPQ کے ساتھ تعامل کرتا ہے، مستحکم HEK293T اور BRD4-miniSOG خلیات جو HEK293T سے زیادہ متاثر ہوتے ہیں، 10 سینٹی میٹر کے برتنوں میں چڑھائے گئے تھے۔سیلز کو کولڈ پی بی ایس سے دھویا گیا اور 1 ملی لیٹر پیئرس آئی پی لیسز بفر (تھرمو فشر، #87787) میں EDTA فری پروٹیز انحیبیٹر کے ساتھ 4 ° C پر 30 منٹ کے لیے لیس کیا گیا۔اس کے بعد، لائسیٹس کو 1.5 ملی لیٹر سینٹری فیوج ٹیوب میں جمع کیا گیا اور 15,871 xg پر 10 منٹ کے لیے 4 ° C پر سینٹرفیوج کیا گیا۔سپرنیٹنٹ کو 5 µg اینٹی V5 لیبل والے ماؤس مونوکلونل اینٹی باڈی (CST, #80076) کے ساتھ رات بھر 4°C پر کاٹا گیا تھا۔تقریباً 50 μl پروٹین A/G مقناطیسی موتیوں (MCE, #HY-K0202) کو دو بار PBS کے ساتھ دھوئیں جس میں 0.5% Tween-20 ہو۔پھر سیل لائسیٹس کو مقناطیسی موتیوں کے ساتھ 4 گھنٹے تک 4 ° C پر نیچے سے اوپر تک گردش کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔پھر موتیوں کو پی بی ایس ٹی بفر کے 1 ملی لیٹر کے ساتھ چار بار دھویا گیا اور 95 ڈگری سینٹی گریڈ پر 5 منٹ تک ابالا۔نمونوں کا تجزیہ SDS-PAGE جیلوں پر کیا گیا اور معیاری مغربی بلٹ طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے PVDF جھلیوں میں منتقل کیا گیا۔جھلیوں کو TBST میں 5% سکم دودھ میں بلاک کر دیا گیا تھا اور پرائمری اور سیکنڈری اینٹی باڈیز کے ساتھ ترتیب وار انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔پرائمری اینٹی باڈی ریبٹ اینٹی ایس ایف پی کیو مونوکلونل اینٹی باڈی (CST، #71992) TBST میں 5% سکم دودھ میں 1:1000 کے تناسب سے استعمال کی گئی تھی اور اسے رات بھر 4°C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔اینٹی خرگوش IgG 1:5000 کے تناسب سے استعمال کیا گیا تھا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔جھلیوں کو کیمیڈوک ایم پی امیجنگ سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے کیمیلومینیسینس کے ذریعہ تصور کیا گیا تھا۔
سالوینٹ ایکسیسبل سرفیس ایریا (SASA) کے تجزیہ کے لیے استعمال ہونے والے تمام ڈھانچے پروٹین ڈیٹا بینک (PDB)52 یا AlphaFold Protein Structure Database53 سے حاصل کیے گئے تھے۔FreeSASA پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے ہر باقیات کے لیے مطلق SASA کا حساب لگایا گیا تھا۔صرف مکمل اور غیر مبہم SASA ڈیٹا کا لیبل لگا ہوا ہسٹائڈائن اور اس کے پڑوسیوں کو ہر ڈھانچے کے لیے اوسط SASA حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ہر ہسٹائڈائن کے لیے رشتہ دار سالوینٹ ایکسیسبیلٹی (RSA) کا حساب سالوینٹ کے لیے دستیاب تجرباتی زیادہ سے زیادہ ممکنہ باقیات کی سطح کے رقبے سے مطلق SASA قدر کو تقسیم کرکے لگایا گیا تھا۔اس کے بعد تمام ہسٹیڈائنز کو پوشیدہ کے طور پر درجہ بندی کیا گیا تھا اگر اوسط RSA 20٪ سے کم تھا، بصورت دیگر بے نقاب 56۔
DDA موڈ میں حاصل کی گئی خام فائلوں کو Proteome Discoverer (v2.5) یا MSfragger (Fragpipe v15.0) کا استعمال کرتے ہوئے مناسب SwissProt تصدیق شدہ پروٹین ڈیٹا بیس میں تلاش کیا گیا جس میں عام آلودگی شامل ہیں۔پیپٹائڈس کو دو لاپتہ کلیویج سائٹس کے ساتھ مکمل ٹرپسن کی ضرورت تھی، کارباموائل میتھیلیشن ایک مقررہ ترمیم کے طور پر اور میتھیونین آکسیڈیشن ایک متحرک ترمیم کے طور پر۔پیشگی اور ٹکڑے کے وزن کی رواداری کو بالترتیب 10 پی پی ایم اور 0.02 Da (MS2 Orbitrap) پر سیٹ کیا گیا تھا۔ آلودہ اثرات کو ہٹا دیا گیا تھا، اور <1% کی غلط دریافت کی شرح حاصل کرنے کے لیے پروٹین کو فلٹر کیا گیا تھا۔ آلودہ اثرات کو ہٹا دیا گیا تھا، اور <1% کی غلط دریافت کی شرح حاصل کرنے کے لیے پروٹین کو فلٹر کیا گیا تھا۔ Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициент ложного обяна %. آلودگی والے ہٹ کو ہٹا دیا گیا اور پروٹین کو فلٹر کیا گیا تاکہ <1% کی غلط پتہ لگانے کی شرح ملے۔去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружени %1 آلودہ اثرات کو ہٹا دیا گیا اور <1% کی غلط مثبت شرح حاصل کرنے کے لیے پروٹین کو فلٹر کیا گیا۔لیبل کے استعمال کے بغیر مقداری تجزیہ کے لیے، تین حیاتیاتی تکرار سے معمول کے مطابق پروٹین کا مواد استعمال کیا گیا تھا۔پروٹین ذیلی سیلولر لوکلائزیشن کا تجزیہ DAVID بایو انفارمیٹکس ریسورسز، MitoCarta 3.0 اور ایلس ٹنگ گروپ کے مرتب اور شائع کردہ ڈیٹا بیس سے جین اونٹولوجی (GO) تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔آتش فشاں کا نقشہ پرسیئس (v1.6.15.0) سے حاصل کیا گیا تھا۔ دو طرفہ ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی اہمیت کے لیے پروٹین کی وافر مقدار میں فولڈ تبدیلیوں کی جانچ کی گئی، اور پروٹین ہٹ کی کثرت تبدیلی>2 (جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا گیا ہو) اور p قدر <0.05 سے شناخت کی گئی۔ دو طرفہ ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی اہمیت کے لیے پروٹین کی وافر مقدار میں فولڈ تبدیلیوں کی جانچ کی گئی، اور پروٹین ہٹ کی کثرت تبدیلی>2 (جب تک کہ دوسری صورت میں بیان نہ کیا گیا ہو) اور p قدر <0.05 سے شناخت کی گئی۔ Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. دو دم والے ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی اہمیت کے لیے پروٹین کے مواد کے فولڈ میں ہونے والی تبدیلیوں کی جانچ کی گئی، اور مواد کی تبدیلی >2 (جب تک کہ دوسری صورت میں نوٹ نہ کیا گیا ہو) اور اے پی ویلیو <0.05 کے ساتھ پروٹین میچز کی شناخت کی گئی۔使用 双边 t 测试 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 命 命 的 的 丰度 变化 变化> 2 （除非 除非 另） 和 P 值 <0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 的 显着性 并 确定 蛋白质 中 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 有 和 和 P 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. پروٹین کے مواد میں فولڈ تبدیلیوں کی شماریاتی اہمیت کو دو دم والے ٹی-ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے جانچا گیا، اور مواد کی تبدیلیوں>2 (جب تک کہ دوسری صورت میں اشارہ نہ کیا گیا ہو) اور p-values ​​<0.05 کے لیے پروٹین میچز کا تعین کیا گیا۔سٹرنگ ڈیٹا بیس کے ساتھ GO تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کے تعامل کا تجزیہ کیا گیا۔
تین حیاتیاتی نقلیں اسی طرح کے نتائج کے ساتھ انجام دی گئیں۔شماریاتی تجزیہ گراف پیڈ پرزم (گراف پیڈ سافٹ ویئر) کے ساتھ کیا گیا تھا اور آتش فشاں پلاٹ پرسیئس (v1.6.15.0) کے ساتھ تیار کیے گئے تھے۔دو گروہوں کا موازنہ کرنے کے لیے، p-values ​​کا تعین دو دم والے طالب علم کے t-ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا تھا۔تجرباتی گروپ میں کم از کم دو بار شناخت کیے گئے صرف سنگلٹن پروٹین کو آتش فشاں پلاٹوں میں شامل کیا گیا تھا، اور کنٹرول گروپ میں اسی طرح کی گمشدہ اقدار کو عام تقسیم سے پرسیوس سے تبدیل کیا گیا تھا تاکہ p-value کا حساب لگایا جا سکے۔ایرر بارز اوسط ± معیاری انحراف کی نمائندگی کرتے ہیں۔شماریاتی تجزیہ کے لیے پروٹومک تجزیوں میں، کم از کم دو حیاتیاتی نقلوں میں ظاہر ہونے والے پروٹین کی کثرت کو برقرار رکھا گیا۔نمونے کے سائز کا پہلے سے تعین کرنے کے لیے شماریاتی طریقے استعمال نہیں کیے گئے تھے۔تجربات بے ترتیب نہیں ہیں۔محققین تجربے اور نتائج کی تشخیص کے دوران کاموں سے اندھے نہیں تھے۔
مطالعہ کے ڈیزائن کے بارے میں مزید معلومات کے لیے، اس مضمون سے منسلک نیچر ریسرچ رپورٹ کا خلاصہ دیکھیں۔
اس مطالعہ میں حاصل کردہ ماس سپیکٹرو میٹری ڈیٹا ڈیٹاسیٹ ID PXD034811 (PDPL-MS ڈیٹاسیٹ) کے تحت iProX57 پارٹنر ریپوزٹری کے ذریعے ProteomeXchange Consortium کو جمع کرایا گیا تھا۔خام ڈیٹا خام ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔یہ مضمون اصل ڈیٹا فراہم کرتا ہے۔
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. پڑوس کو جاننا: پروٹین کمپلیکس اور نقشہ آرگنیلز کی خصوصیت کے لیے قربت پر منحصر بایوٹینیلیشن کا استعمال۔ Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. پڑوس کو جاننا: پروٹین کمپلیکس اور نقشہ آرگنیلز کی خصوصیت کے لیے قربت پر منحصر بایوٹینیلیشن کا استعمال۔Gingras, AS, Abe, KT اور Raut, B. ماحول سے واقفیت: پروٹین کمپلیکس اور نقشہ آرگنیلز کی خصوصیت کے لیے قربت پر منحصر بایوٹینیلیشن کا استعمال۔ Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. پڑوس کو سمجھنا: حیاتیاتی زندگی پر پڑوس کا انحصار استعمال کریں۔Gingras, AS, Abe, KT اور Raut, B. قربت کو سمجھنا: پروٹین کمپلیکس کی خصوصیات اور قربت پر منحصر بایوٹینیلیشن کا استعمال کرتے ہوئے آرگنیلز کی نقشہ سازی۔کرنٹمیری رائے.کیمیکل۔حیاتیات 48، 44–54 (2019)۔
گیری، جے بی وغیرہ۔ڈیکسٹر توانائی کو مدافعتی خلیوں میں منتقل کرکے مائیکرو ماحولیات کا نقشہ بنانا۔سائنس 367، 1091–1097 (2020)۔
Hertling، EL et al.دو پروٹوم اسکیل نیٹ ورکس انسانی تعامل کی سیل مخصوص دوبارہ تشکیل کا پتہ لگاتے ہیں۔سیلز 184، 3022–3040.e3028 (2021)۔