خبریں

متعدی بیماریوں کا پتہ لگانے کے لیے روایتی تشخیصی حکمت عملیوں کے لیے بینچ ٹاپ آلات کے استعمال کی ضرورت ہوتی ہے جو پوائنٹ آف کیئر ٹیسٹنگ (POCT) کے لیے موزوں نہیں ہیں۔ابھرتی ہوئی مائیکرو فلائیڈکس ایک انتہائی چھوٹی، خودکار، اور مربوط ٹیکنالوجی ہے جو تیز، کم لاگت، درست آن سائٹ تشخیص کے روایتی طریقوں کا ممکنہ متبادل ہے۔مالیکیولر تشخیصی طریقے مائکرو فلائیڈک آلات میں پیتھوجین کا پتہ لگانے کے سب سے مؤثر طریقوں کے طور پر بڑے پیمانے پر استعمال ہوتے ہیں۔یہ جائزہ علمی اور صنعتی دونوں نقطہ نظر سے متعدی بیماریوں کی مائکرو فلائیڈک پر مبنی مالیکیولر تشخیص میں حالیہ پیشرفت کا خلاصہ کرتا ہے۔سب سے پہلے، ہم نیوکلک ایسڈز کی ایک مخصوص آن چپ پروسیسنگ کی وضاحت کرتے ہیں، بشمول نمونہ پری ٹریٹمنٹ، ایمپلیفیکیشن، اور سگنل ریڈنگ۔پھر چار قسم کے مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارمز کی خصوصیات، فوائد اور نقصانات کا موازنہ کیا جاتا ہے۔اگلا، ہم نیوکلک ایسڈ کی مطلق مقدار کے لیے ڈیجیٹل اسیس کے استعمال پر بات کریں گے۔کلاسیکی اور حالیہ تجارتی مائکرو فلائیڈک پر مبنی مالیکیولر تشخیصی آلات کا خلاصہ مارکیٹ کی موجودہ حالت کے ثبوت کے طور پر کیا گیا ہے۔آخر میں، ہم متعدی بیماریوں کی مائیکرو فلائیڈک تشخیص کے لیے مستقبل کی ہدایات تجویز کرتے ہیں۔
متعدی بیماریاں پیتھوجینز کی وجہ سے ہوتی ہیں، بشمول بیکٹیریا، وائرس اور طفیلی، جو پوری دنیا میں پھیلے ہوئے ہیں۔دیگر بیماریوں کے برعکس، پیتھوجینز تیزی سے متاثر ہو جاتے ہیں اور ٹیکہ لگانے، ہوا اور پانی کے ذرائع کے ذریعے انسانوں اور میزبان جانوروں کے درمیان پھیل جاتے ہیں [1]۔صحت عامہ کے اقدام کے طور پر متعدی بیماریوں کی روک تھام بہت ضروری ہے۔متعدی بیماریوں سے نمٹنے کے لیے تین اہم حکمت عملی: (1) انفیکشن کے منبع کو کنٹرول کرنا۔(2) ترسیل کے راستے میں رکاوٹ؛(3) حساس آبادیوں کا تحفظ۔اہم حکمت عملیوں میں، سہولت اور کم لاگت کی وجہ سے انفیکشن کے منبع کو کنٹرول کرنا سب سے اہم حکمت عملی سمجھا جاتا ہے۔متاثرہ افراد کی تیزی سے تشخیص، الگ تھلگ اور علاج انتہائی اہم ہے، جس کے لیے تیز، حساس اور درست تشخیصی حکمت عملیوں کی ضرورت ہوتی ہے [2]۔متعدی بیماریوں کی موجودہ تشخیص عام طور پر علامات اور علامات پر مبنی طبی معائنہ اور لیبارٹری مطالعات جیسے سیل کلچر اور مالیکیولر تشخیص کو یکجا کرتی ہے، جس کے لیے تربیت یافتہ عملہ، محنت سے بھرپور طریقہ کار، اور مہنگے ٹیسٹنگ آلات کی ضرورت ہوتی ہے [3، 4]۔متعدی بیماری کے پھیلنے کی روک تھام کے لیے تیز رفتار، سستی اور درست مقامی تشخیص کی ضرورت ہوتی ہے، خاص طور پر وسائل سے محدود علاقوں میں جہاں متعدی بیماریاں عام اور شدید ہوتی ہیں [5]، نیز بیابانوں یا میدان جنگ میں علاج، جہاں ہنگامی حالات غیر متوقع ہوتے ہیں۔.طبی دیکھ بھال محدود ہے [6]۔اس تناظر میں، مائیکرو فلائیڈکس ایک ایسی ٹیکنالوجی ہے جو مائیکرو الیکٹرو مکینیکل سسٹمز ٹیکنالوجیز، نینو ٹیکنالوجی، یا مادی سائنس کو درست سیال ہیرا پھیری [7,8,9,10] کے لیے جوڑتی ہے، جو پوائنٹ آف کیئر ڈیٹیکشن (POCT) کے لیے نئے امکانات فراہم کرتی ہے۔ہسپتالوں اور لیبارٹریوں کے باہر متعدی ایجنٹ۔روایتی وقت استعمال کرنے والی تشخیص کے مقابلے میں، مائیکرو فلائیڈک ٹیکنالوجی بیماری کے پھیلنے کے دوران سالماتی تشخیص کے لیے نمونہ اور لاگت کی بچت پیش کرتی ہے۔کورونا وائرس کی بیماری 2019 (COVID-19) کا عالمی پھیلاؤ شدید ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم کورونا وائرس 2 (SARS-CoV-2) کی وجہ سے ہوا ہے، اس لیے وبائی مرض کی بروقت روک تھام اور کنٹرول کے لیے مائکرو فلائیڈکس کی اہمیت پر ایک بار پھر زور دیا گیا ہے [11, 12 ، 13]۔روایتی تشخیص کے برعکس، مائیکرو فلائیڈک پی او سی ٹی نمونے لینے کے مقام کے قریب ٹیسٹ کرنے کے لیے بینچ ٹاپ اینالائزرز سے لے کر چھوٹی سائیڈ اسٹریم ٹیسٹ سٹرپس تک چھوٹے پورٹیبل ڈیوائسز کا استعمال کرتا ہے [14]۔ان ٹیسٹوں میں سادہ یا بغیر نمونے کی تیاری، تیز سگنل ایمپلیفیکیشن، اور حساس سگنل ریڈنگ شامل ہیں جس کے نتیجے میں مختصر دورانیہ اور منٹوں میں درست نتائج برآمد ہوتے ہیں۔مائیکرو فلائیڈک پر مبنی صحت کی دیکھ بھال کے آلات کی دستیابی اور بڑے پیمانے پر پیداوار نے ہسپتال کے باہر، مریض کے قریب، اور یہاں تک کہ گھر میں بھی ان کی لاگت سے موثر اور براہ راست تشخیصی ایپلی کیشنز کو بڑھا دیا ہے۔
متعدی بیماریوں کی تشخیص کے لیے موجودہ حکمت عملیوں میں، سالماتی تشخیص سب سے زیادہ حساس میں سے ایک ہے [15، 16]۔اس کے علاوہ، مالیکیولر ڈائیگنوسٹکس کو اکثر COVID-19 کے مسلسل پتہ لگانے کے لیے سونے کے معیار کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، جس سے مدافعتی ردعمل کے آغاز سے پہلے RNA یا DNA کے وائرس سے متعلق مخصوص علاقوں کا براہ راست پتہ لگانے کی اجازت ملتی ہے [17, 18]۔موجودہ جائزے میں، ہم متعدی امراض کے لیے مائیکرو فلائیڈکس پر مبنی مالیکیولر تشخیصی عمل میں تازہ ترین پیشرفت پیش کرتے ہیں، علمی نقطہ نظر سے مستقبل کے صنعتی نقطہ نظر تک (تصویر 1)۔ہم نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کے تین اہم مراحل کے ساتھ شروع کریں گے: آن چپ نمونہ پری ٹریٹمنٹ، نیوکلک ایسڈ ایمپلیفیکیشن، اور سگنل ریڈنگ۔اس کے بعد ہم نے مختلف قسم کے مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارمز کا ان کی ساخت اور فنکشن کے ساتھ موازنہ کیا، جو منفرد خصوصیات (طاقت اور کمزوریاں) دکھاتے ہیں۔ڈیجیٹل نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے پر مزید بحث کی گئی ہے اور اسے متعدی پیتھوجین مالیکیولز کی مکمل مقدار کے لیے تیسری نسل کی ٹیکنالوجی کی مثال کے طور پر دیا گیا ہے۔اس کے علاوہ، مالیکیولر تشخیص کے لیے مائیکرو فلائیڈک POCT مارکیٹ کی موجودہ حالت کو ظاہر کرنے کے لیے کئی عام اور جدید ترین تجارتی POCT آلات پیش کیے جائیں گے۔ہم مستقبل کی درخواستوں کے لیے اپنے وژن پر بھی تبادلہ خیال اور وضاحت کریں گے۔
نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کے لیے مائیکرو فلائیڈک چپس کے ماڈیولز کو ان کے افعال [19] کے مطابق تین زمروں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔ان ماڈیولز میں، سیمپلنگ ماڈیول بنیادی طور پر نمونہ لیسس اور نیوکلک ایسڈ نکالنے کا احساس کرتا ہے۔سینسر ماڈیول بنیادی طور پر نیوکلک ایسڈ سگنلز کی تبدیلی اور پرورش کو کنٹرول کرتا ہے۔سگنلنگ ماڈیول سینسنگ ماڈیول کے ذریعہ تبدیل شدہ اور پروسیس شدہ سگنل کا پتہ لگاتا ہے۔ایک چپ پر نیوکلک ایسڈز کا پتہ لگانے کے عمل کی بنیاد پر، ہم مختلف چپس کا خلاصہ کریں گے جو "ان پٹ اور آؤٹ پٹ" فنکشن کو محسوس کر سکتے ہیں۔
نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کا پہلا مرحلہ نیوکلک ایسڈ نکالنا ہے، یعنی ہدف نیوکلک ایسڈ کو اصل نمونے سے الگ کرنا۔نیوکلک ایسڈ نکالنے کا عمل نیوکلک ایسڈ کو دیگر سالماتی آلودگیوں سے پاک کرنے، نیوکلک ایسڈ مالیکیولز کی بنیادی ساخت کی سالمیت کو یقینی بنانے اور نتائج کو بہتر بنانے کے لیے کیا جاتا ہے۔نیوکلک ایسڈ نکالنے کے لیے ضروری نمونہ لیسس اور نیوکلک ایسڈ کیپچر کی ضرورت ہوتی ہے، جس کے معیار اور کارکردگی کا تحقیق اور تشخیصی نتائج پر بہت زیادہ اثر پڑتا ہے۔نکالنے کے دوران کوئی بھی لطیف ضمنی اثرات مزید پتہ لگانے کو محدود کر سکتے ہیں۔مثال کے طور پر، پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) اور لوپ آئسوتھرمل ایمپلیفیکیشن (LAMP) کے طریقے کچھ بقایا نامیاتی سالوینٹس جیسے ایتھنول اور آئسوپروپانول نیوکلک ایسڈ آئسولیشن ریجنٹس [20] میں روکتے ہیں۔نیوکلک ایسڈز کو الگ تھلگ کرنے کے لیے مائع مائع نکالنا اور ٹھوس فیز نکالنا سب سے مقبول طریقے ہیں [21]، تاہم، چپ پر مائع مائع نکالنا انتہائی محدود ہے، کیونکہ مائع مائع نکالنے میں استعمال ہونے والے ریجنٹس زیادہ تر مائیکرو فلائیڈک چپس کے سنکنرن کا سبب بنتے ہیں۔ .یہاں، ہم مائیکرو رے پر مبنی ٹھوس فیز نکالنے کے طریقوں کو نمایاں کرتے ہیں اور ان کے فوائد اور نقصانات کا موازنہ کرتے ہیں۔
سیلیکون ایک سبسٹریٹ مواد ہے جو نیوکلک ایسڈز کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے کیونکہ اس کی بایو کمپیٹیبلٹی، استحکام، اور ترمیم میں آسانی ہے [22]۔اہم بات یہ ہے کہ جب سلیکا یا دیگر مواد کے ساتھ ترمیم کی جاتی ہے، تو یہ مرکب کم پی ایچ، اعلی نمک کی حالتوں میں منفی چارج شدہ نیوکلک ایسڈ کو جذب کرنے کے لیے خصوصیات کو ظاہر کرتا ہے جبکہ ہائی پی ایچ، کم نمک کے محلول کے ساتھ خارج ہوتا ہے۔اس رجحان کی بنیاد پر، نیوکلک ایسڈ کو پاک کرنا ممکن ہے۔
مائیکرو فلائیڈکس میں نیوکلک ایسڈ نکالنے کے لیے سلیکا پر مبنی مواد کی مختلف شکلیں استعمال کی گئی ہیں، جیسے کہ سلیکا موتیوں، پاؤڈرز، مائیکرو فائبر فلٹرز، اور سلیکا جھلیوں [23، 24، 25، 26]۔مواد کی خصوصیات پر منحصر ہے، سلیکون پر مبنی مواد مختلف طریقوں سے مائکرو سرکٹس میں استعمال کیا جا سکتا ہے.مثال کے طور پر، سیلیکا گرینولز، پاؤڈرز، اور کمرشل نینو فلٹرز کو آسانی سے مائیکرو فلائیڈک چپس کے سوراخوں یا مائیکرو چینلز میں رکھا جا سکتا ہے اور نمونوں سے نیوکلک ایسڈ نکالنے میں مدد کرتے ہیں [27، 28، 29]۔سطح پر نظر ثانی شدہ سلیکا جھلیوں کو بھی ڈی این اے کو تیزی سے پیتھوجینز سے کم قیمت پر پاک کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔مثال کے طور پر، وانگ وغیرہ۔chitosan oligosaccharides کے ساتھ لیپت سلیکا جھلیوں کے ساتھ vesicle-mediated chain exchange کے ساتھ denaturing amplification reactions کو ملا کر، ایک ورسٹائل پورٹیبل سسٹم متعارف کرایا گیا جس نے 102-108 کالونی بنانے والی اکائیوں کا کامیابی سے پتہ لگایا۔(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus.، اور وائرس کی موجودگی آسانی سے دکھائی دے رہی تھی۔پاول وغیرہ۔[31] سلیکون پر مبنی مائیکرو رے اس کے بعد ہیپاٹائٹس سی وائرس (HCV)، ہیومن امیونو وائرس (HIV)، زیکا وائرس، اور ہیومن پیپیلوما وائرس اور خود کار طریقے سے پھیلاؤ کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیے گئے، جس میں RNA وائرس کو پکڑنے کے لیے 1.3 μl ٹارٹوس مائیکرو ری ایکٹر تیار کیا گیا۔اور سیٹو ایمپلیفیکیشن میں انجام دیں۔ان طریقوں کے علاوہ، سطح پر تبدیل شدہ سلیکا مائیکرو کالم بھی نیوکلک ایسڈ نکالنے میں کلیدی کردار ادا کرتے ہیں، کیونکہ ترمیم کرنے والے مواد کی جیومیٹری اور خصوصیات نکالنے کی کارکردگی میں بہت زیادہ اضافہ کرتی ہیں۔چن وغیرہ۔[32] نے امینو لیپت سلیکون مائیکرو کالم پر مبنی کم ارتکاز والے آر این اے کو الگ تھلگ کرنے کے لیے ایک مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم تجویز کیا۔یہ مائیکرو فلائیڈک ڈیوائس سلکان سبسٹریٹ پر 0.25 سینٹی میٹر 2 مائیکرو پلرز کی ایک صف کو مربوط کرتا ہے تاکہ اعلی سطحی رقبہ سے حجم کے تناسب کے ڈیزائن کے ذریعے زیادہ نکالنے کی کارکردگی حاصل کی جا سکے۔اس ڈیزائن کا فائدہ یہ ہے کہ مائیکرو فلائیڈک ڈیوائس 95٪ تک نیوکلک ایسڈ نکالنے کی کارکردگی حاصل کر سکتی ہے۔یہ سلیکون پر مبنی حکمت عملی کم قیمت پر نیوکلک ایسڈز کو تیزی سے الگ تھلگ کرنے کی قدر کو ظاہر کرتی ہیں۔مائیکرو فلائیڈک چپس کے ساتھ مل کر، سلکان پر مبنی نکالنے کی حکمت عملی نہ صرف نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کی کارکردگی کو بڑھا سکتی ہے، بلکہ تجزیاتی آلات کے چھوٹے بنانے اور انضمام کو بھی آسان بنا سکتی ہے [20]۔
مقناطیسی علیحدگی کے طریقے مقناطیسی ذرات کو بیرونی مقناطیسی میدان کی موجودگی میں نیوکلک ایسڈ کو الگ کرنے کے لیے استعمال کرتے ہیں۔عام طور پر استعمال ہونے والے مقناطیسی ذرات میں Fe3O4 یا γ-Fe2O3 مقناطیسی ذرات شامل ہیں جو سلیکا، امینو اور کاربوکسائل کے ساتھ لیپت ہیں [33,34,35,36]۔سلیکون پر مبنی SPE طریقوں کے مقابلے میں مقناطیسی ذرات کی امتیازی خصوصیت بیرونی میگنےٹس کے ساتھ ہیرا پھیری اور کنٹرول میں آسانی ہے۔
نیوکلک ایسڈز اور سیلیکا کے درمیان الیکٹرو اسٹاٹک تعامل کا استعمال کرتے ہوئے، زیادہ نمک اور کم پی ایچ کی حالت میں، نیوکلک ایسڈ سلیکا لیپت مقناطیسی ذرات کی سطح پر جذب ہوتے ہیں، جبکہ کم نمک اور زیادہ پی ایچ کی حالت میں، مالیکیولز کو دھویا جا سکتا ہے۔ دوبارہ.سیلیکا لیپت مقناطیسی موتیوں نے مقناطیسی طور پر کنٹرول شدہ حرکت کا استعمال کرتے ہوئے بڑے حجم کے نمونوں (400 μL) سے DNA نکالنا ممکن بنایا ہے [37]۔ایک مظاہرے کے طور پر، Rodriguez-Mateos et al.[38] مختلف چیمبروں میں مقناطیسی موتیوں کی منتقلی کو کنٹرول کرنے کے لیے ٹیون ایبل میگنےٹ کا استعمال کیا۔سلیکا لیپت مقناطیسی ذرات کی بنیاد پر، SARS-CoV-2 جینومک RNA کی 470 کاپیاں/mL کو LAMP ریورس ٹرانسکرپشن ڈیٹیکشن (RT-LAMP) کے لیے گندے پانی کے نمونوں سے نکالا جا سکتا ہے اور جواب 1 گھنٹے کے اندر پڑھا جا سکتا ہے۔ننگی آنکھ (تصویر 2a)۔
مقناطیسی اور غیر محفوظ مواد پر مبنی آلات۔SARS-CoV-2 RNA کا پتہ لگانے کے لیے IFAST RT-LAMP مائکرو فلائیڈک ڈیوائس کا تصوراتی خاکہ ([38] سے اخذ کردہ)۔b buccal swab nucleic acid کے dSPE کے لیے سینٹرفیوگل مائیکرو ڈیوائس ([39] سے اخذ کردہ)۔c FTA® کارڈ کا استعمال کرتے ہوئے بلٹ ان سیلف پاورڈ سیمپل کنسنٹیٹر ([50] سے اخذ کردہ)۔d فیوژن 5 فلٹر پیپر کو چیٹوسن کے ساتھ تبدیل کیا گیا ([51] سے اخذ کیا گیا)۔SARS-CoV-2 شدید ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم کورونا وائرس 2، RT-LAMP ریورس ٹرانسکرپشن لوپ ثالثی آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن، ایف ٹی اے فائنڈرز ٹیکنالوجی پارٹنرز، این اے نیوکلک ایسڈ
مثبت چارج شدہ مقناطیسی ذرات نیوکلک ایسڈ کی فاسفیٹ ریڑھ کی ہڈی کو جوڑنے کے لیے مثالی ہیں۔نمک کے ایک خاص ارتکاز پر، نیوکلک ایسڈز کے منفی چارج شدہ فاسفیٹ گروپس کو مقناطیسی مرکب ذرات کی سطح پر مثبت طور پر چارج کیا جا سکتا ہے۔لہٰذا، نیوکلک ایسڈ نکالنے کے لیے کھردری سطح اور امینو گروپس کی اعلی کثافت والے مقناطیسی نینو پارٹیکلز تیار کیے گئے۔مقناطیسی علیحدگی اور بلاک کرنے کے بعد، مقناطیسی نینو پارٹیکلز اور ڈی این اے کمپلیکس کو پی سی آر میں براہ راست استعمال کیا جا سکتا ہے، جس سے پیچیدہ اور وقت گزاری صاف کرنے اور اخراج کے آپریشنز کی ضرورت ختم ہو جاتی ہے [35]۔منفی کاربوکسائل گروپس کے ساتھ لیپت مقناطیسی نینو پارٹیکلز کو بھی اعلی ارتکاز والی پولی تھیلین گلائکول اور سوڈیم کلورائیڈ محلولوں میں سطحوں پر جذب ہونے والے نیوکلک ایسڈز کو الگ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے [36]۔ان سطحی ترمیم شدہ مقناطیسی موتیوں کے ساتھ، ڈی این اے نکالنے کے بعد کے پروردن کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے۔Dignan et al.[39] نے نیوکلک ایسڈ پریٹریٹمنٹ کے لیے ایک خودکار اور پورٹیبل سینٹری فیوگل مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم بیان کیا، جو غیر تکنیکی عملے کو سائٹ پر استعمال کرنے کی اجازت دیتا ہے۔اس کے علاوہ، LAMP کے ساتھ الگ تھلگ ڈی این اے کی مطابقت، ایک طریقہ جو پوائنٹ آف کیئر نیوکلک ایسڈ تجزیہ کے لیے موزوں ہے، مزید کم سے کم سامان کی ضروریات اور رنگین پیمائش کے لیے موزوں ہونے کو ظاہر کرتا ہے (تصویر 2b)۔
مقناطیسی مالا کے طریقے خود کار طریقے سے نکالنے کا امکان پیش کرتے ہیں، جن میں سے کچھ تجارتی خودکار نیوکلک ایسڈ ایکسٹریکٹرز میں موجود ہیں [KingFisher;تھرمو فشر (والتھم، ایم اے، یو ایس اے)، QIAcube® HT؛CapitalBio (بیجنگ، چین) اور Biomek®؛بیک مین (میامی، امریکہ)۔فلوریڈا، USA)]۔مائیکرو فلائیڈکس کے ساتھ مقناطیسی موتیوں کو ملانے کے فوائد نیوکلک ایسڈ کے موثر خودکار نکالنے کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں، جو ممکنہ طور پر سالماتی تشخیص کی ترقی کو آگے بڑھا سکتے ہیں۔تاہم، مائیکرو فلائیڈکس کے ساتھ مقناطیسی موتیوں کا امتزاج اب بھی مقناطیسی موتیوں کے عین مطابق ہیرا پھیری کے لیے پیچیدہ کنٹرول سسٹمز پر بہت زیادہ انحصار کرتا ہے، جو تجارتی مصنوعات کے بھاری اور مہنگے ہونے کی وضاحت کرتا ہے، جو POCT میں مقناطیسی موتیوں کے مزید اطلاق کو محدود کرتا ہے۔
کئی غیر محفوظ مواد جیسے ترمیم شدہ نائٹروسیلوز فلٹرز، فائنڈرز ٹیکنالوجی ایسوسی ایٹس (ایف ٹی اے) کارڈز، پولیتھرسلفون پر مبنی فلٹر پیپرز، اور گلائکن کوٹیڈ مواد کو بھی نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا ہے [40, 41, 42, 43, 44]۔غیر محفوظ ریشے دار مواد جیسے کہ ریشے دار کاغذ کو سب سے پہلے ڈی این اے کو الگ تھلگ کرنے کے لیے طویل عرصے سے پھنسے ہوئے ڈی این اے مالیکیولوں کو ریشوں کے ساتھ جسمانی طور پر الجھانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔چھوٹے سوراخ ڈی این اے مالیکیولز کی مضبوط جسمانی پابندی کا باعث بنتے ہیں، جو ڈی این اے کے اخراج کو مثبت طور پر متاثر کرتے ہیں۔ریشے دار کاغذ کے مختلف تاکنا سائز کی وجہ سے، نکالنے کی کارکردگی ڈی این اے پروردن کی ضروریات کو پورا نہیں کر سکتی [45، 46]۔ایف ٹی اے کارڈ ایک تجارتی فلٹر پیپر ہے جو فرانزک میڈیسن کے شعبے میں استعمال ہوتا ہے اور سالماتی تشخیص کے دیگر شعبوں میں وسیع پیمانے پر استعمال ہوتا ہے۔نمونے میں خلیے کی جھلیوں کو لیس کرنے کے لیے مختلف کیمیکلز سے رنگے ہوئے سیلولوز فلٹر پیپر کے استعمال کے ذریعے، جاری ہونے والا ڈی این اے 2 سال تک انحطاط سے محفوظ رہتا ہے۔ابھی حال ہی میں، SARS-CoV-2، لیشمانیاسس، اور ملیریا [47,48,49] سمیت مختلف پیتھوجینز کے مالیکیولر پتہ لگانے کے لیے رنگدار سیلولوز پیپر تیار کیا گیا ہے۔الگ تھلگ پلازما میں ایچ آئی وی کو براہ راست لیس کیا جاتا ہے، اور وائرل نیوکلک ایسڈ FTA® فلو میمبرین میں افزودہ ہوتا ہے جو کنسنٹریٹر میں بنی ہوتی ہے، جو نیوکلک ایسڈ [50] (تصویر 2c) کی موثر پیداوار کی اجازت دیتی ہے۔ایف ٹی اے کارڈز کا استعمال کرتے ہوئے نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے میں بنیادی مسئلہ یہ ہے کہ گوانائیڈائن اور آئسوپروپینول جیسے کیمیکلز بعد میں ہونے والے ایمپلیفیکیشن ری ایکشن کو روکتے ہیں۔اس مسئلے کو حل کرنے کے لیے، ہم نے فیوژن 5 chitosan-modified filter paper تیار کیا، جس میں DNA مالیکیولز اور ریشے دار فلٹر پیپر کی فزیکل انٹرلیسنگ، اور chitosan-modified compounds پر DNA کے الیکٹرو سٹیٹک جذب کے فوائد کو یکجا کیا گیا ہے تاکہ انتہائی موثر نیوکلک ایسڈ نکالا جا سکے۔ ..فلٹر فائبرز [51] (تصویر 2 ڈی)۔اسی طرح، Zhu et al.[52] نے زیکا وائرس آر این اے کی تیزی سے تنہائی اور پتہ لگانے کے لیے ان سیٹو کیپلیری مائیکرو فلائیڈک نظام پر مبنی چائٹوسن میں ترمیم شدہ پی سی آر طریقہ کا مظاہرہ کیا۔نیوکلک ایسڈز کو chitosan کی آن/آف سوئچ خاصیت کی بنیاد پر بالترتیب ایک مخلوط lysate/PCR میڈیم میں جذب/جذب کیا جا سکتا ہے۔آن اور آف"، پی ایچ کے لیے جوابدہ۔
جیسا کہ اوپر ذکر کیا گیا ہے، یہ حکمت عملی مختلف ٹھوس مرحلے کے مواد کے فوائد کو یکجا کرتی ہے اور مائکرو فلائیڈکس میں نیوکلک ایسڈ نکالنے کی کارکردگی کو بڑھاتی ہے۔عملی ایپلی کیشنز میں، بڑی مقدار میں ان مواد کا استعمال غیر اقتصادی ہے، اور مناسب سطح کا علاج یا ان مواد کے ساتھ عام مواد کی سطح میں ترمیم بھی ان کے کام کو محفوظ رکھ سکتی ہے۔لہذا، یہ خیال کیا جاتا ہے کہ پائلٹ مطالعہ کے بعد ان حکمت عملیوں پر عمل درآمد اخراجات کو کم کر سکتا ہے.
مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارمز پر نیوکلک ایسڈ کی جانچ اکثر چھوٹے نمونے والیوم (<100 µl) کا استعمال کرتی ہے، اس لیے مخصوص تحقیقات کے ساتھ ہدف والے نیوکلک ایسڈ کو ایک ایسے سگنل میں تبدیل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے جو نیچے کی دھارے کا پتہ لگانے کے لیے آسان ہو (آپٹیکل، برقی، اور مقناطیسی) [53، 54]۔ مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارمز پر نیوکلک ایسڈ کی جانچ اکثر چھوٹے نمونے والیوم (<100 µl) کا استعمال کرتی ہے، اس لیے مخصوص تحقیقات کے ساتھ ہدف والے نیوکلک ایسڈ کو ایک ایسے سگنل میں تبدیل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے جو نیچے کی دھارے کا پتہ لگانے کے لیے آسان ہو (آپٹیکل، برقی، اور مقناطیسی) [53، 54]۔ При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارمز پر نیوکلک ایسڈز کی جانچ کرتے وقت، چھوٹے نمونے والے حجم (<100 µL) اکثر استعمال کیے جاتے ہیں، اس لیے خصوصی تحقیقات کے ساتھ ہدف والے نیوکلک ایسڈز کی افزائش کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ اسے بعد میں پتہ لگانے کے لیے آسان سگنل میں تبدیل کیا جا سکے (آپٹیکل، برقی، اور مقناطیسی) [53، 54]۔微流控 平台 的 核酸 核酸 检测 通常 使用 （（（<100 µl） ， 需要 使用 特定 探针 探针 扩增 目标 核酸 ， ， 转换 便于 下游 下游 检测 （、 、 电学 电学 磁学） 的 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 信号 光学 、 、 、 电学]微流控 平台 的 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（（<100 µl） ， 需要 特定 探针 探针 扩增 目标 ， 以 以 转换 为 下游 （光学 光学 、 磁学 磁学） 的 信号 [53 ، 54 ، 54 ، 54 ] Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارمز پر نیوکلک ایسڈز کی کھوج میں عام طور پر چھوٹے نمونوں کی مقدار (<100 μl) کا استعمال کیا جاتا ہے، جس کے لیے خصوصی تحقیقات کے ساتھ ہدف والے نیوکلک ایسڈز کو آگے بڑھانے کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ انہیں بعد میں پتہ لگانے کے لیے سگنل میں تبدیل کیا جا سکے (آپٹیکل، برقی اور مقناطیسی) [53, 54]] .مائکرو فلائیڈکس میں نیوکلک ایسڈ پروردن بھی رد عمل کو تیز کرسکتا ہے، پتہ لگانے کی حدود کو بہتر بنا سکتا ہے، نمونے کی ضروریات کو کم کرسکتا ہے، اور پتہ لگانے کی درستگی کو بہتر بنا سکتا ہے [55، 56]۔حالیہ برسوں میں، تیز رفتار اور درست پتہ لگانے کے ساتھ، مائیکرو فلائیڈکس میں مختلف نیوکلک ایسڈ ایمپلیفیکیشن کے طریقے لاگو کیے گئے ہیں، جن میں پی سی آر اور کچھ آئسوتھرمل ایمپلیفیکیشن ری ایکشن شامل ہیں۔یہ سیکشن مائیکرو فلائیڈک سسٹمز پر مبنی نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کے طریقوں کا خلاصہ کرے گا۔
پی سی آر کسی جاندار کے ڈی این اے کی نقل تیار کرنے کے عمل کا ایک نقالی ہے، جس کا نظریہ کسی اور جگہ تفصیل سے بیان کیا گیا ہے اور یہاں اس پر بحث نہیں کی جائے گی۔PCR بہت کم مقدار میں ہدف DNA/RNA کو تیز رفتاری سے بڑھا سکتا ہے، PCR کو نیوکلک ایسڈز کی تیزی سے پتہ لگانے کا ایک طاقتور ذریعہ بناتا ہے۔حالیہ دہائیوں میں، PCR تھرمل سائیکلنگ سسٹمز سے لیس بہت سے پورٹیبل مائیکرو فلائیڈک ڈیوائسز پوائنٹ آف کیئر تشخیص کی ضروریات کو پورا کرنے کے لیے تیار کیے گئے ہیں [57, 58]۔آن چپ پی سی آر کو درجہ حرارت پر قابو پانے کے مختلف طریقوں کے مطابق چار اقسام میں تقسیم کیا جا سکتا ہے (روایتی، مسلسل بہاؤ، مقامی طور پر سوئچ، اور کنویکٹیو پی سی آر) [59]۔مثال کے طور پر، Gee et al.[60] نے گلے کے جھاڑو کے نمونوں میں SARS-CoV-2، انفلوئنزا A اور B وائرس کے ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے کے لیے اپنے مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم پر براہ راست ریورس ٹرانسکرپشن مقداری PCR (RT-qPCR) طریقہ تیار کیا (تصویر 3a)۔پارک وغیرہ۔[61] نے پتلی فلم PCR، الیکٹروڈز، اور انگلی سے چلنے والے پولیڈیمیتھائلسلوکسین پر مبنی مائیکرو فلائیڈک ماڈیول کو یکجا کرکے ایک سادہ پیتھوجین تجزیہ چپ بنایا۔تاہم، دونوں کام روایتی پی سی آر کی عام خامیوں کو مجسم کرتے ہیں۔پی سی آر کو تھرمل سائیکلنگ کی ضرورت ہوتی ہے، جس سے ڈیوائس کے مزید چھوٹے ہونے اور جانچ کا وقت کم ہوتا ہے۔
اس مسئلے کو حل کرنے کے لیے مسلسل بہاؤ پر مبنی مائیکرو فلائیڈک اور اسپیس سوئچڈ پی سی آر کی ترقی اہم ہے۔لمبے سرپینٹائن چینل یا ایک مختصر سیدھے چینل کا استعمال کرتے ہوئے، مسلسل بہاؤ PCR ایک آف چپ پمپ کے ساتھ تین پری ہیٹ زونز میں فعال طور پر ری ایجنٹس کو گردش کر کے تیز رفتاری فراہم کر سکتا ہے۔یہ آپریشن مختلف رد عمل کے درجہ حرارت کے درمیان منتقلی کے مرحلے سے کامیابی سے بچاتا ہے اور اس طرح جانچ کے وقت کو نمایاں طور پر کم کرتا ہے [62] (تصویر 3b)۔جنگ ایٹ ال کی ایک اور تحقیق میں۔[63] نے ایک نیا روٹری پی سی آر جینیاتی تجزیہ کار تجویز کیا جو الٹرا فاسٹ اور ملٹی پلیکس ریورس ٹرانسکرپشن پی سی آر (تصویر 3 سی) کے لیے فکسڈ اور فلو پی سی آر کی خصوصیات کو یکجا کرتا ہے۔نیوکلک ایسڈ ایمپلیفیکیشن کے لیے، پی سی آر مائکروچپ کو مختلف درجہ حرارت پر تین ہیٹنگ بلاکس کے ذریعے گھمایا جائے گا: 1. ڈینیچریشن بلاک 94°C، 2. اینیلنگ بلاک 58°C پر، 3. توسیعی بلاک 72°C پر۔
مائکرو فلائیڈکس میں پی سی آر کا اطلاق۔مائکرو فلائیڈک پلیٹ فارم پر dirRT-qPCR کی منصوبہ بندی کی نمائندگی ([60] سے موافقت)۔b ایک مسلسل بہاؤ پی سی آر مائیکرو رے کی اسکیمیٹک نمائندگی جو سرپینٹائن چینل پر مبنی ہے ([62] سے موافقت)۔c ایک روٹری پی سی آر جینیاتی تجزیہ کار کی اسکیمیٹک نمائندگی، جس میں ایک مائیکروچپ، تین ہیٹنگ بلاکس اور ایک سٹیپر موٹر شامل ہے ([63] سے اخذ کردہ)۔d سینٹرفیوگریشن اور سیٹ اپ کے ساتھ تھرمو کنویکشن پی سی آر کا خاکہ ([64] سے اخذ کیا گیا)۔DirRT-qPCR، براہ راست مقداری ریورس ٹرانسکرپشن پولیمریز چین ری ایکشن
کیپلیریوں اور لوپس یا یہاں تک کہ پتلی پلیٹوں کا استعمال کرتے ہوئے، کنویکشن پی سی آر کسی بیرونی پمپ کی ضرورت کے بغیر قدرتی فری تھرمل کنویکشن کے ذریعے نیوکلک ایسڈ کو تیزی سے بڑھا سکتا ہے۔مثال کے طور پر، ایک سائیکلک اولیفین پولیمر مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم ایک من گھڑت گھومنے والے حرارتی مرحلے پر تیار کیا گیا تھا جو پی سی آر لوپ مائیکرو چینل [64] (تصویر 3d) میں سینٹرفیوگریشن کے ساتھ تھرمل سائیکلنگ کا استعمال کرتا ہے۔رد عمل کا حل تھرمل کنویکشن سے چلتا ہے، جو مائیکرو چینل میں کنڈلی ساخت کے ساتھ اعلی اور کم درجہ حرارت کا مسلسل تبادلہ کرتا ہے۔70.5 pg/چینل کی کھوج کی حد کے ساتھ پورے ایمپلیفیکیشن کا عمل 10 منٹ میں مکمل کیا جا سکتا ہے۔
جیسا کہ توقع کی گئی ہے، ریپڈ پی سی آر مکمل طور پر مربوط نمونہ ردعمل مالیکیولر تشخیصی اور ملٹی پلیکس تجزیہ کے نظام کے لیے ایک طاقتور ٹول ہے۔ریپڈ پی سی آر SARS-CoV-2 کا پتہ لگانے کے لیے درکار وقت کو نمایاں طور پر کم کرتا ہے، جو COVID-19 وبائی مرض کے موثر کنٹرول میں معاون ہے۔
پی سی آر کو ایک پیچیدہ تھرمل سائیکلر کی ضرورت ہوتی ہے جو پی او سی ٹی کے لیے موزوں نہیں ہے۔ابھی حال ہی میں، آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن تکنیکوں کا اطلاق مائیکرو فلائیڈکس پر کیا گیا ہے، جس میں ایل اے ایم پی، ریکومبینیس پولیمریز ایمپلیفیکیشن (RPA)، اور نیوکلک ایسڈ کی ترتیب [65,66,67,68] پر مبنی ایمپلیفیکیشن شامل ہیں لیکن ان تک محدود نہیں۔ان تکنیکوں کے ساتھ، نیوکلک ایسڈز کو مسلسل درجہ حرارت پر بڑھایا جاتا ہے، جو مالیکیولر تشخیص کے لیے کم قیمت، انتہائی حساس پورٹیبل POCT آلات کی تخلیق میں سہولت فراہم کرتا ہے۔
ہائی تھرو پٹ مائیکرو فلائیڈکس پر مبنی LAMP اسیسز متعدی بیماریوں کی متعدد شناخت کی اجازت دیتے ہیں [42, 69, 70, 71]۔سینٹرفیوگل مائیکرو فلائیڈک نظام کے ساتھ مل کر، LAMP نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کے آٹومیشن کو مزید سہولت فراہم کر سکتا ہے [69, 72, 73, 74, 75]۔اسپن اور ری ایکٹ سلپ چِپ کو LAMP [76] (تصویر 4a) کا استعمال کرتے ہوئے متعدد متوازی بیکٹیریا کی بصری کھوج کے لیے تیار کیا گیا تھا۔پرکھ میں آپٹمائزڈ LAMP استعمال کرتے وقت، فلوروسینس سگنل ٹو شور کا تناسب تقریباً 5 گنا تھا، اور پتہ لگانے کی حد جینومک DNA کی 7.2 کاپیاں/μl تک پہنچ گئی۔ مزید برآں، پانچ عام ہاضمہ بیکٹیریل پیتھوجینز کا وجود، بشمول Bacillus cereus، Escherichia coli، Salmonella enterica، Vibrio fluvialis اور Vibrio parahaemolyticus، کو <60 منٹ میں طریقہ کی بنیاد پر تصور کیا گیا۔ مزید برآں، پانچ عام ہاضمہ بیکٹیریل پیتھوجینز کا وجود، بشمول Bacillus cereus، Escherichia coli، Salmonella enterica، Vibrio fluvialis اور Vibrio parahaemolyticus، کو <60 منٹ میں طریقہ کی بنیاد پر تصور کیا گیا۔مزید یہ کہ، ہاضمہ کے پانچ عام بیکٹیریل پیتھوجینز کی موجودگی، بشمول Bacillus cereus، Escherichia coli، Salmonella enterica، Vibrio fluvialis اور Vibrio parahaemolyticus، کو 60 منٹ سے بھی کم وقت میں اس طریقے کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا۔此外 基于 该 方法 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 五 常见 消化道 原体 的 的 存在 ， 包括 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 大 、 肠 沙门 氏 菌 菌 菌 菌 、 、 和 副溶血性 弧菌。。。。此外 基于 该 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 常见 细菌病 的 存在 ， 芽孢杆菌 芽孢杆菌 、 大 大 肠杆菌 肠 菌 、 弧菌 弧菌 和 和 副溶血 副溶血 性 性 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPاس کے علاوہ، پانچ عام بیکٹیریل معدے کے پیتھوجینز کی موجودگی، بشمول Bacillus cereus، Escherichia coli، Salmonella enterica، Vibrio fluvius، اور Vibrio parahaemolyticus، اس طریقہ کو استعمال کرتے ہوئے 60 منٹ سے بھی کم وقت میں تصور کیا گیا۔
مائیکرو فلائیڈکس میں LAMP کے فوائد میں، دوسروں کے درمیان، تیز ردعمل اور چھوٹے سے پتہ لگانا شامل ہیں۔تاہم، رد عمل کے درجہ حرارت (تقریباً 70 ° C) کی وجہ سے، LAMP کے دوران لامحالہ ایروسول پیدا ہوتے ہیں، جس کے نتیجے میں غلط مثبت شرح زیادہ ہوتی ہے۔پرکھ کی خصوصیت، پرائمر ڈیزائن، اور درجہ حرارت کے کنٹرول کو بھی LAMP کے لیے بہتر بنانے کی ضرورت ہے۔اس کے علاوہ، چپ ڈیزائن جو ایک ہی چپ پر متعدد ہدف کا پتہ لگانے کو لاگو کرتے ہیں وہ بہت اہمیت کے حامل ہیں اور انہیں تیار کیا جانا چاہیے۔اس کے علاوہ، LAMP ایک چپ میں ضم شدہ کثیر مقصدی پتہ لگانے کے لیے موزوں ہے، جو کہ بہت اہمیت کا حامل ہے، لیکن ترقی کے لیے ابھی بھی کافی گنجائش باقی ہے۔
LAMP کی اعلی غلط مثبت شرح کو جزوی طور پر RPA کے ساتھ کم کیا جا سکتا ہے، کیونکہ نسبتاً کم رد عمل کا درجہ حرارت (~37 °C) کے نتیجے میں نسبتاً کم بخارات کے مسائل پیدا ہوتے ہیں [77]۔آر پی اے سسٹم میں، دو مخالف پرائمر ڈی این اے کی ترکیب کو ایک ریکومبینیز سے منسلک کرکے شروع کرتے ہیں اور 10 منٹ [78,79,80,81] کے اندر ایمپلیفیکیشن مکمل کیا جا سکتا ہے۔لہذا، RPA کا پورا عمل PCR یا LAMP سے زیادہ تیز ہے۔حالیہ برسوں میں، مائکرو فلائیڈک ٹیکنالوجی کو RPA [82,83,84] کی رفتار اور درستگی کو مزید بہتر بنانے کے لیے دکھایا گیا ہے۔مثال کے طور پر، Liu et al.[85] ریورس ٹرانسکرپشن RPA (RT-RPA) اور ایک عالمگیر لیٹرل فلو ٹیسٹ سٹرپ کا پتہ لگانے کے نظام کو مربوط کرکے SARS-CoV-2 کی تیز رفتار اور حساس شناخت کے لیے ایک مائیکرو فلائیڈک انٹیگریٹڈ لیٹرل فلو پولیمریز ریکومبینیز ایمپلیفیکیشن پرکھ تیار کیا۔ایک واحد مائکرو فلائیڈک نظام میں۔شکل 4b)۔پتہ لگانے کی حد 1 کاپی/µl یا 30 کاپیاں/ نمونہ ہے، اور پتہ لگانے کو تقریباً 30 منٹ میں مکمل کیا جا سکتا ہے۔کانگ وغیرہ۔پہننے کے قابل مائکرو فلائیڈک ڈیوائس تیار کی ہے۔[86] RPA (شکل 4c) کا استعمال کرتے ہوئے تیزی سے اور براہ راست HIV-1 DNA کا پتہ لگانے کے لیے جسمانی درجہ حرارت اور موبائل فون پر مبنی فلوروسینس کا پتہ لگانے کا نظام استعمال کیا۔پہننے کے قابل RPA پرکھ 24 منٹ کے اندر ہدف کی ترتیب کی 100 کاپیاں/mL کا پتہ لگاتا ہے، جو کہ وسائل کی محدود ترتیبات میں HIV-1 سے متاثرہ شیر خوار بچوں کی تیزی سے تشخیص کی بڑی صلاحیت کو ظاہر کرتا ہے۔
پوائنٹ آف کیئر ٹیسٹنگ (POCT) میں آئس تھرمل ایمپلیفیکیشن۔اسپن اور رد عمل SlipChip کی ترقی اور پیداوار۔پلازما ویلڈنگ کے بعد، اوپر اور نیچے کی چپس کو گری دار میوے کے ایک سیٹ کے ساتھ جمع کیا گیا تاکہ حتمی چپ بنائی جا سکے ([76] سے موافقت)۔b COVID-19 کا پتہ لگانے کے لیے MI-IF-RPA سسٹم کا اسکیمیٹک ([85] سے اخذ کردہ)۔c HIV-1 DNA کی تیزی سے پتہ لگانے کے لیے پہننے کے قابل RPA ٹیسٹ کا اسکیمیٹک ([86] سے اخذ کردہ)۔SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, human immunodeficiency virus HIV, RPA recombinase polymerase amplification, LED light emitting dio-combinase-Li-combinase-re-flumise-re-fly-combinase-LED لائٹ ایمیٹنگ وسعت
Microfluidic پر مبنی RPA تیزی سے ترقی کر رہا ہے، تاہم، چپ بنانے اور رد عمل کی کھپت کی لاگت بہت زیادہ ہے اور اس ٹیکنالوجی کی دستیابی کو بڑھانے کے لیے اسے کم کرنا ضروری ہے۔اس کے علاوہ، RPA کی اعلیٰ حساسیت غیر مخصوص مصنوعات کی افزائش کو متاثر کر سکتی ہے، خاص طور پر آلودگی کی موجودگی میں۔یہ حدود مائیکرو فلائیڈک سسٹمز میں آر پی اے کے اطلاق کو متاثر کر سکتی ہیں اور مزید بہتر بنانے کے قابل ہو سکتی ہیں۔POCT میں RPA پر مبنی مائیکرو فلائیڈک حکمت عملیوں کی فزیبلٹی کو بہتر بنانے کے لیے مختلف اہداف کے لیے اچھی طرح سے ڈیزائن کیے گئے پرائمر اور پروبس کی بھی ضرورت ہے۔
Cas13 اور Cas12a میں نیوکلک ایسڈز کو تصادفی طور پر صاف کرنے کی صلاحیت ہے اور اس طرح انہیں پتہ لگانے اور تشخیصی ٹولز کے طور پر تیار کیا جا سکتا ہے۔Cas13 اور Cas12a بالترتیب DNA یا RNA کو نشانہ بنانے کے پابند ہونے پر چالو ہوتے ہیں۔ایک بار چالو ہونے کے بعد، پروٹین دیگر قریبی نیوکلک ایسڈز کو توڑنا شروع کر دیتا ہے، جس کے بعد گائیڈ RNAs جو کہ پیتھوجین کے لیے مخصوص نیوکلک ایسڈز کو نشانہ بناتا ہے، بجھنے والے فلوروسینٹ پروبس کو ختم کر سکتا ہے اور فلوروسینس جاری کر سکتا ہے۔اس نظریہ کی بنیاد پر، Kellner et al.[87] نے Cas13 پر مبنی طریقہ [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking (SHERLOCK)]، اور Broughton et al.[88] نے Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)] پر مبنی ایک اور نقطہ نظر تیار کیا۔
حالیہ برسوں میں، CRISPR پر مبنی نیوکلک ایسڈز کا پتہ لگانے کے مختلف طریقے سامنے آئے ہیں [89, 90]۔روایتی سی آر آئی ایس پی آر پر مبنی طریقے نیوکلک ایسڈ نکالنے، ایمپلیفیکیشن اور سی آر آئی ایس پی آر کا پتہ لگانے سمیت متعدد طریقہ کار کی وجہ سے اکثر وقت طلب اور محنت طلب ہوتے ہیں۔ہوا میں مائعات کی نمائش غلط مثبت نتائج کے امکانات کو بڑھا سکتی ہے۔مندرجہ بالا کو دیکھتے ہوئے، CRISPR پر مبنی نظاموں کو اصلاح کی اشد ضرورت ہے۔
CRISPR-Cas12a اور CRISPR-Cas13a کا پتہ لگانے والے ایپلی کیشنز کے لیے ایک نیومیٹک کنٹرولڈ مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم جو متوازی طور پر 24 تجزیے کر سکتا ہے تیار کیا گیا ہے [91]۔یہ نظام فلوروسینس کا پتہ لگانے والے آلے سے لیس ہے جو نیوکلک ایسڈ ایمپلیفیکیشن کو نظرانداز کرتا ہے اور خود بخود فیمٹومولر ڈی این اے اور آر این اے کے نمونوں کا پتہ لگاتا ہے۔چن وغیرہ۔سنٹری فیوگل مائیکرو فلائیڈکس (تصویر 5a) میں CRISPR-Cas12a سسٹم کے ساتھ مربوط ریکومبینیز ایمپلیفیکیشن۔یہ کام ان دو عملوں کو یکجا کرنے کی دشواری پر قابو پاتا ہے کیونکہ Cas12a میسنجر ڈی این اے کو ہضم کرسکتا ہے اور امپلیفیکیشن کے عمل کو روک سکتا ہے۔اس کے علاوہ، چن وغیرہ۔[92] اس کے علاوہ خود بخود پورے عمل کو مکمل کرنے کے لیے ایک سینٹری فیوگل مائیکرو فلائیڈک کنٹرول میں ری ایکشن ری ایجنٹس کو پہلے سے محفوظ کر لیا۔ایک اور کام میں، سلوا وغیرہ۔[93] نے CRISPR/Cas12a ایمپلیفیکیشن کے بغیر تشخیصی طریقہ تیار کیا اور SARS-CoV-2 (تصویر 5b) کا پتہ لگانے کے لیے اسمارٹ فون تیار کیا۔یہ پرکھ، جسے سیل فون پر مبنی ایمپلیفیکیشن فری سسٹم کے نام سے جانا جاتا ہے، اس میں ایک CRISPR/Cas پر منحصر انزائم شامل ہے جو مائیکرو فلائیڈک چینلز میں کیٹالیس سے پیدا ہونے والے ببل سگنلز کے سمارٹ فون کے تصور پر مبنی ہے۔نیوکلک ایسڈ کی 50 کاپیوں/µl سے کم کی حساسیت کا پتہ لگانے میں پری ایمپلیفیکیشن، نمونے کے انجیکشن سے لے کر سگنل پڑھنے تک کے پورے عمل میں صرف 71 منٹ لگتے ہیں۔
CRISPR پر مبنی نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کے طریقے۔CRISPR پر مبنی مربوط مالیکیولر تشخیص کے لیے سینٹرفیوگل POCT ([92] سے اخذ کردہ)۔b SARS-CoV-2 کے اسمارٹ فون پر مبنی تجزیہ کے لیے CASCADE ٹیسٹ کی ترقی ([93] سے اخذ کردہ)۔RAA recombinase ایمپلیفیکیشن، PAM ملحقہ پروٹو اسپیسر شکل، CRISPR کلسٹرڈ مختصر پیلینڈرومک ریپیٹ باقاعدگی سے وقفوں پر، CASCADE سسٹم بغیر سیل فون ایمپلیفیکیشن کے ساتھ CRISPR/CAS پر منحصر انزائمز، 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] کاربوڈائیڈیمائڈ ای ڈی سی
نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کے آخری مرحلے کے طور پر، سگنل کا پتہ لگانا براہ راست تشخیصی نتائج کی عکاسی کرتا ہے اور ایک موثر، حساس اور درست POCT کی ترقی میں ایک اہم عنصر ہے۔سگنلز کو مختلف طریقوں سے پڑھا جا سکتا ہے جیسے فلوروسینٹ، الیکٹرو کیمیکل، رنگین میٹرک اور مقناطیسی حکمت عملی۔اس سیکشن میں، ہم ہر ایک نقطہ نظر کی دلیل بیان کرتے ہیں اور مائیکرو فلائیڈکس میں متعدی بیماریوں کی سالماتی تشخیص کا موازنہ کرتے ہیں۔
بہترین حساسیت، کم لاگت، آپریشن میں آسانی، اور نقطہ نظر کے تجزیہ [94, 95] کے قابل ذکر فوائد کی وجہ سے متعدی بیماریوں کی POCT تشخیص کے لیے فلوروسینس پر مبنی حکمت عملی بڑے پیمانے پر استعمال ہوتی ہے۔یہ حکمت عملی قابل شناخت سگنل (فلوریسنس بڑھانے یا بجھانے) بنانے کے لیے لیبل لگے ہوئے فلوروفورس جیسے فلوروسینٹ رنگ اور نینو میٹریلز کا استعمال کرتی ہے۔اس تلاش سے پتہ چلتا ہے کہ فلوروسینس پر مبنی حکمت عملیوں کو براہ راست فلوروسینٹ لیبلنگ، سگنل آن، اور سگنل آف فلوروسینٹ ڈیٹیکشن [96] میں تقسیم کیا جاسکتا ہے۔براہ راست فلوروسینٹ لیبل کا پتہ لگانے میں مخصوص ligands کو لیبل کرنے کے لیے خصوصی فلوروسینٹ لیبلز کا استعمال کیا جاتا ہے جو منتخب طور پر کسی ہدف سے منسلک ہونے پر فلوروسینس کی مخصوص مقدار پیدا کرتے ہیں۔سگنل پر مبنی فلوروسینس کا پتہ لگانے کے لیے، فلوروسینٹ سگنل کا معیار دلچسپی کی شدت سے مثبت طور پر متعلق ہے۔ہدف کی عدم موجودگی میں فلوروسینس کی شدت نہ ہونے کے برابر ہے اور ہدف کی کافی مقدار موجود ہونے پر اس کا پتہ لگایا جا سکتا ہے۔اس کے برعکس، "سگنل آف" فلوروسینس کے ذریعے دریافت ہونے والی فلوروسینس کی شدت ہدف کی مقدار کے الٹا متناسب ہے، ابتدائی طور پر زیادہ سے زیادہ قدر تک پہنچ جاتی ہے اور ہدف کے بڑھنے کے ساتھ ساتھ آہستہ آہستہ کم ہوتی جاتی ہے۔مثال کے طور پر، CRISPR-Cas13a ہدف پر منحصر ٹرانس کلیویج میکانزم کا استعمال کرتے ہوئے، Tian et al.[97] نے RNAs کا پتہ لگانے کے لیے ایک نئی شناخت کی حکمت عملی تیار کی جو ریورس ٹرانسکرپشن کو براہ راست نظرانداز کرتے ہیں (تصویر 6a)۔تکمیلی ہدف RNAs کے پابند ہونے پر، CRISPR-Cas13-RNA کمپلیکس کو چالو کیا جا سکتا ہے، جو غیر مخصوص رپورٹر RNAs کے ذریعے ٹرانسکولیٹرل کلیویج کو متحرک کرتا ہے۔فلوروسینٹلی لیبل لگا ہوا رپورٹر [فلوروفور (F)] بجھانے والا (Q) برقرار رہتا ہے اور جب چالو کمپلیکس کے ذریعے کلیو کیا جاتا ہے تو فلوروسیس ہوتا ہے۔
الیکٹرو کیمیکل کا پتہ لگانے کا فائدہ اعلی پتہ لگانے کی رفتار، آسان پیداوار، کم قیمت، لے جانے میں آسان اور خودکار کنٹرول ہے۔یہ POCT ایپلی کیشنز کے لیے ایک طاقتور تجزیاتی طریقہ ہے۔گرافین فیلڈ ایفیکٹ ٹرانزسٹر گاو ایٹ ال کی بنیاد پر۔2 pg/mL (تصویر 6b) کی حد کے ساتھ بوریلیا برگڈورفیری بیکٹیریا سے لائم بیماری کے اینٹیجنز کی ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے کے لیے ایک نینو بایوسینسر تیار کیا۔
پورٹیبلٹی، کم لاگت، تیاری میں آسانی، اور بصری پڑھنے کے فوائد سے مستفید ہوتے ہوئے، POCT ایپلی کیشنز میں Colorimetric Asses استعمال کیے گئے ہیں۔Colorimetric کا پتہ لگانے میں peroxidase یا peroxidase-like nanomaterials کے آکسیکرن، nanomaterials کی جمع، اور ٹارگٹ نیوکلک ایسڈ کی موجودگی کے بارے میں معلومات کو نظر آنے والی رنگ کی تبدیلیوں میں تبدیل کرنے کے لیے اشارے کے رنگوں کے اضافے کا استعمال کیا جا سکتا ہے [99, 100, 101]۔خاص طور پر، سونے کے نینو پارٹیکلز کو کلر میٹرک حکمت عملیوں کی نشوونما میں بڑے پیمانے پر استعمال کیا جاتا ہے، اور ان کی تیز رفتار اور اہم رنگ کی تبدیلیوں کو آمادہ کرنے کی صلاحیت کی وجہ سے، متعدی بیماریوں کی حالت کی تشخیص کے لیے POCT کلومیٹرک پلیٹ فارمز کی ترقی میں دلچسپی بڑھ رہی ہے [102]۔ایک مربوط سینٹری فیوگل مائیکرو فلائیڈک ڈیوائس [103] کے ساتھ، آلودہ دودھ کے نمونوں میں خوراک سے پیدا ہونے والے پیتھوجینز کا خود بخود 10 بیکٹیریل سیلز کی سطح پر پتہ لگایا جا سکتا ہے، اور نتائج کو 65 منٹ کے اندر اندر بصری طور پر پڑھا جا سکتا ہے (تصویر 6c)۔
مقناطیسی سینسنگ تکنیک مقناطیسی مواد کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کاروں کا درست پتہ لگا سکتی ہے، اور حالیہ دہائیوں میں POCT ایپلی کیشنز میں خاصی دلچسپی رہی ہے۔مقناطیسی سینسنگ تکنیک کے کچھ منفرد فوائد ہیں جیسے مہنگے نظری اجزاء کے بجائے کم لاگت والے مقناطیسی مواد۔تاہم، مقناطیسی میدان کا استعمال پتہ لگانے کی کارکردگی کو بہتر بناتا ہے اور نمونے کی تیاری کے وقت کو کم کرتا ہے [104]۔مزید برآں، مقناطیسی جانچ کے نتائج حیاتیاتی نمونوں کے غیر معمولی مقناطیسی پس منظر کے سگنل کی وجہ سے اعلی خصوصیت، حساسیت، اور اعلی سگنل ٹو شور کے تناسب کو ظاہر کرتے ہیں [105]۔شرما وغیرہ۔پورٹیبل مائیکرو چِپ پلیٹ فارم میں مقناطیسی ٹنل جنکشن پر مبنی بائیو سینسر کو مربوط کیا۔پیتھوجینز کے ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے کے لیے (تصویر 6 ڈی)۔بایو سینسرز حساس طور پر پیتھوجینز سے الگ تھلگ سبنانومولر نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگاتے ہیں۔
عام سگنل کا پتہ لگانے کا طریقہ۔Cas13a کے ہائپر لوکلائزڈ پتہ لگانے کا تصور ([97] سے اخذ کیا گیا)۔b Graphene nanobiosensor FET Lyme GroES scFv کے ساتھ مل کر ([98] سے اخذ کردہ)۔c سینٹری فیوگل مائیکرو فلائیڈک چپ میں خوراک سے پیدا ہونے والے پیتھوجینز کے ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے کے لیے رنگین اشارے: نمبر 1 اور نمبر 3 کے نمونے ہدف پیتھوجینز کے ساتھ، اور نمبر 2، نمبر 4 اور نمبر 5 نمونے بغیر ہدف کے پیتھوجینز کے ([103] سے اخذ کردہ) .d بائیو سینسر مقناطیسی سرنگ کے جنکشن پر مبنی ہے، جس میں ایک پلیٹ فارم، بلٹ ان بلاکنگ ایمپلیفائر، ایک کنٹرول یونٹ، اور سگنل جنریشن/ایکوزیشن کے لیے پاور سپلائی شامل ہے ([106] سے اخذ کردہ)۔GFET Graphene FET، Escherichia coli، Escherichia coli، Salmonella typhimurium، Vibrio parahaemolyticus، Vibrio parahaemolyticus، Listeria monocytogenes، PC PC، PDMS Dimethicone، PMMA پولیمتھائل میتھ کریلیٹ
مندرجہ بالا پتہ لگانے کے طریقوں کی عمدہ خصوصیات کے باوجود، ان کے اب بھی نقصانات ہیں۔ان طریقوں کا موازنہ کیا جاتا ہے (ٹیبل 1)، بشمول تفصیلات کے ساتھ کچھ ایپلیکیشنز (فائدہ اور نقصانات)۔
مائیکرو فلائیڈکس، مائیکرو الیکٹرو مکینیکل سسٹمز، نینو ٹیکنالوجی اور مٹیریل سائنس کی ترقی کے ساتھ، متعدی بیماریوں کا پتہ لگانے کے لیے مائیکرو فلائیڈک چپس کا استعمال مسلسل آگے بڑھ رہا ہے [55,96,107,108]۔چھوٹے آلات اور سیالوں کی درست ہیرا پھیری تشخیصی درستگی اور لاگت کی تاثیر میں معاون ہے۔لہذا، مزید ترقی کے لیے، چپس کو بہتر بنانے اور اپ گریڈ کرنے کی کوششیں کی گئی ہیں، جس کے نتیجے میں مختلف مائیکرو فلائیڈک چپس مختلف ساختوں اور افعال کے ساتھ بنتی ہیں۔یہاں ہم مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم کی کئی عام اقسام کا مختصراً تعارف کراتے ہیں اور ان کی خصوصیات (فائدہ اور نقصانات) کا موازنہ کرتے ہیں۔اس کے علاوہ، ذیل میں دی گئی زیادہ تر مثالیں بنیادی طور پر SARS-CoV-2 کا مقابلہ کرنے پر مرکوز ہیں۔
LOCCs سب سے عام چھوٹے پیچیدہ تجزیاتی نظام ہیں اور ان کے آپریشنز انتہائی چھوٹے، مربوط، خودکار اور نمونے کے انجیکشن اور تیاری، بہاؤ کنٹرول اور مائع کا پتہ لگانے سے متوازی ہوتے ہیں [109, 110]مائعات کو احتیاط سے ڈیزائن کی گئی جیومیٹری اور بہت سے جسمانی اثرات کے تعامل جیسے پریشر گریڈینٹ، کیپلیری ایکشن، برقی حرکیات، مقناطیسی میدانوں اور صوتی لہروں کے ذریعے ہیرا پھیری کی جاتی ہے [111]۔LOCC تیز رفتار تجزیہ کی رفتار، چھوٹے نمونے کے سائز، کم بجلی کی کھپت، اور اعلی انتظام اور آپریشن کی کارکردگی کے ساتھ ہائی تھرو پٹ اسکریننگ اور ایک سے زیادہ پتہ لگانے میں بہترین فوائد دکھاتا ہے۔تاہم، LOCC ڈیوائسز بہت نازک ہیں، اور مینوفیکچرنگ، پیکیجنگ، اور انٹرفیسنگ۔تاہم، ملٹی پلیکسنگ اور دوبارہ استعمال کو بہت زیادہ مشکلات کا سامنا کرنا پڑتا ہے [96]۔دوسرے پلیٹ فارمز کے مقابلے میں، LOCC کے زیادہ سے زیادہ ایپلیکیشن تنوع اور بہترین ٹیکنالوجی کی مطابقت کے لحاظ سے منفرد فوائد ہیں، لیکن اس کے نقصانات بھی واضح ہیں، یعنی زیادہ پیچیدگی اور ناقص ریپیٹبلٹی۔بیرونی پمپوں پر انحصار، جو اکثر بھاری اور مہنگے ہوتے ہیں، POCT میں ان کے استعمال کو مزید محدود کرتے ہیں۔
COVID-19 پھیلنے کے دوران، LOCC کو بہت زیادہ توجہ ملی۔ایک ہی وقت میں، کئی نئی چپس ہیں جو کئی ٹیکنالوجیز کو یکجا کرتی ہیں۔مثال کے طور پر، اسمارٹ فونز اب بڑے پیمانے پر پورٹیبل تجزیاتی آلات کے طور پر استعمال ہوتے ہیں اور ان میں LOCC انضمام کی بڑی صلاحیت ہے۔سورج وغیرہ۔[21] نے ایک مائیکرو فلائیڈک چپ بنائی جو کہ SARS-CoV-2 سمیت پانچ پیتھوجینز کے مخصوص نیوکلک ایسڈ کی ترتیب کو ملٹی پلیکس کرنے کی اجازت دیتی ہے، LAMP کا استعمال کرتے ہوئے اور ردعمل کے اختتام کے بعد 1 گھنٹے کے اندر اسمارٹ فون کا استعمال کرتے ہوئے ان کا تجزیہ کیا۔ایک اور مثال کے طور پر، سندہ وغیرہ۔اسمارٹ فونز کا استعمال کرتے ہوئے SARS-CoV-2 RNA اہداف کا براہ راست اور حساس پتہ لگانے کے لیے [112] نے ایک مالیکیولر سوئچ [کیٹلیٹک ایمپلیفیکیشن بذریعہ مالیکیولر ٹرانزیشن اسٹیٹ سوئچ (CATCH)] بنایا۔ CATCH پورٹیبل LOCC کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے اور اعلی کارکردگی حاصل کرتا ہے (تقریبا 8 RNA کاپیاں/μl؛ کمرے کے درجہ حرارت پر <1 h) [112]۔ CATCH پورٹیبل LOCC کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے اور اعلی کارکردگی حاصل کرتا ہے (تقریبا 8 RNA کاپیاں/μl؛ کمرے کے درجہ حرارت پر <1 h) [112]۔ کیچ совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (مثال کے طور پر 8 копий РНК/мкл; < 1. CATCH پورٹیبل LOCC کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے اور بہترین تھرو پٹ فراہم کرتا ہے (تقریباً 8 RNA کاپیاں/µl؛ کمرے کے درجہ حرارت پر <1 h) [112]۔ 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时） [112] کو پکڑو۔ 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时） [112] کو پکڑو۔ کیچ совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (مثال کے طور پر 8 копий РНК/мкл; < 1 чам. CATCH پورٹیبل LOCCs کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے اور اس کی بہترین کارکردگی ہے (تقریباً 8 RNA کاپیاں/µl؛ کمرے کے درجہ حرارت پر <1 گھنٹہ) [112]۔اس کے علاوہ، سالماتی تشخیص کے لیے LOCC آلات بھی کچھ محرک قوتوں کا استعمال کرتے ہیں جیسے ویکیوم، اسٹریچ، اور الیکٹرک فیلڈز۔کانگ وغیرہ۔ویکیوم پلاسمونک مائع پی سی آر چپ کا استعمال کرتے ہوئے فیلڈ میں COVID-19 کی تیز رفتار اور مقداری تشخیص کے لیے ریئل ٹائم، انتہائی تیز نینو پلازما آن اے چپ پی سی آر کا مظاہرہ کیا۔لی وغیرہ۔[114] بعد میں اسٹریچ سے چلنے والی مائکرو فلائیڈک چپ تیار کی جس نے COVID-19 کی تشخیص کو قابل بنایا۔یہ پلیٹ فارم RT-LAMP ایمپلیفیکیشن سسٹم کا استعمال کرتا ہے تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا کوئی نمونہ معیار کے لحاظ سے مثبت ہے یا منفی۔اس کے بعد، رام چندرن وغیرہ۔[115] نے isotachophoresis (ITP) کا استعمال کرتے ہوئے مناسب الیکٹرک فیلڈ گریڈینٹ حاصل کیا، جو کہ مائکرو فلائیڈکس میں لاگو کی جانے والی ایک منتخب آئن فوکس کرنے والی تکنیک ہے۔ITP کے ساتھ، خام nasopharyngeal swab کے نمونوں سے ہدف RNA خود بخود صاف کیا جا سکتا ہے۔پھر رامچندرن وغیرہ۔[115] اس ITP پیوریفیکیشن کو ITP سے بہتر LAMP اور CRISPR assays کے ساتھ ملا کر تقریباً 35 منٹ میں انسانی nasopharyngeal swab اور طبی نمونوں میں SARS-CoV-2 کا پتہ چلا۔اس کے علاوہ، نئے خیالات مسلسل ابھر رہے ہیں.جادھو وغیرہ۔[116] نے مائیکرو فلائیڈک ڈیوائس کے ساتھ مل کر سطح سے بہتر رمن سپیکٹروسکوپی پر مبنی ایک تشخیصی اسکیم تجویز کی جس میں یا تو عمودی اورینٹڈ گولڈ/ سلور لیپت کاربن نانوٹوبس یا ڈسپوزایبل الیکٹرو اسپن مائیکرو/نانو ٹیوبز ہوں۔جھلی سے کام کرنے والے بلٹ ان فلٹر مائکرو چینلز ڈسپوزایبل ہیں۔یہ آلہ جسم کے مختلف رطوبتوں/ اخراج جیسے تھوک، ناسوفرینکس اور آنسوؤں سے وائرس کو جذب کرتا ہے۔اس طرح، وائرس ٹائٹر وافر مقدار میں ہے اور رامان کے دستخط سے وائرس کی درست شناخت کی جا سکتی ہے۔
LOAD ایک سینٹری فیوگل مائکرو فلائیڈک پلیٹ فارم ہے جس میں تمام عمل فریکوئنسی پروٹوکول کے ذریعے کنٹرول کیے جاتے ہیں جو ایک مائیکرو اسٹرکچرڈ سبسٹریٹ کو گھماتا ہے [110]۔LOAD ڈیوائس کی خصوصیت سینٹرفیوگل فورس کو ایک اہم محرک قوت کے طور پر استعمال کرتے ہوئے ہے۔مائعات بھی کیپلیری، یولر اور کوریولیس فورسز کے تابع ہیں۔سینٹری فیوج ڈیوائس کا استعمال کرتے ہوئے، ریڈیل اندر کی طرف سے باہر کی پوزیشن تک مسلسل مائع آپریشن میں تجزیہ کیا جاتا ہے، جس سے اضافی بیرونی نلیاں، پمپ، ایکچویٹرز، اور فعال والوز کی ضرورت کو ختم کیا جاتا ہے۔مختصر میں، ایک واحد کنٹرول طریقہ آپریشن کو آسان بناتا ہے۔لوڈ سینٹر سے ایک ہی فاصلے پر ایک ہی مائکرو فلائیڈک چینل میں مائع پر کام کرنے والی قوتیں برابر ہیں، جو چینل کی ساخت کو دہرانا ممکن بناتی ہیں۔اس طرح، LOAD کا سامان روایتی LOCC آلات کے مقابلے ڈیزائن اور تیاری کے لیے آسان اور زیادہ کفایتی ہے، جبکہ رد عمل بڑی حد تک آزاد اور متوازی ہوتے ہیں۔تاہم، سینٹری فیوگل آلات کی اعلی مکینیکل طاقت کی وجہ سے، دستیاب چپ مواد محدود ہے اور چھوٹے حجم مشکل ہیں۔گاڑی کوایک ہی وقت میں، زیادہ تر LOAD آلات صرف ایک ہی استعمال کے لیے بنائے گئے ہیں، جو بڑے پیمانے پر پتہ لگانے کے لیے مہنگے ہیں [96, 117, 118, 119]۔
حالیہ دہائیوں میں، LOAD، جو سب سے ذہین مائیکرو فلائیڈک آلات میں سے ایک سمجھا جاتا ہے، نے محققین اور مینوفیکچررز کی طرف سے کافی توجہ حاصل کی ہے۔اس طرح، LOAD نے وسیع پیمانے پر قبولیت حاصل کی ہے اور اسے متعدی پیتھوجینز [120, 121, 122, 123, 124] کی مالیکیولر تشخیص کے لیے استعمال کیا گیا ہے، خاص طور پر COVID-19 پھیلنے کے دوران۔مثال کے طور پر، 2020 کے آخر میں، Ji et al.[60] نے گلے کے جھاڑو کے نمونوں میں SARS-CoV-2 اور انفلوئنزا A اور B کے انفیکشن کی تیز رفتار اور خودکار متوازی پتہ لگانے کے لئے براہ راست RT-qPCR پرکھ کا مظاہرہ کیا۔پھر Xiong et al.[74] نے 40 منٹ کے اندر سات انسانی سانس کے کورونا وائرس بشمول SARS-CoV-2 کی تیز، درست اور بیک وقت پتہ لگانے کے لیے LAMP سے مربوط ڈسکوائیڈ مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم پیش کیا۔2021 کے اوائل میں، de Oliveira et al.[73] نے COVID-19 کی RT-LAMP مالیکیولر تشخیص کے لیے ایک پولی اسٹیرین ٹونر سینٹری فیوگل مائکرو فلائیڈک چپ کا مظاہرہ کیا، جسے انگلی کے نوک پر روٹیٹر سے دستی طور پر چلایا جاتا ہے۔اس کے بعد، Dignan et al.[39] نے SARS-CoV-2 RNA کو براہ راست بکل سویب سیکشنز سے صاف کرنے کے لیے ایک خودکار پورٹیبل سنٹری فیوج مائیکرو ڈیوائس پیش کی۔Medved et al.[53] نے ایک ان لائن SARS-CoV-2 ایروسول سیمپلنگ سسٹم کی تجویز پیش کی جس میں چھوٹے حجم میں گھومنے والی مائکرو فلائیڈک فلوروسینٹ چپ 10 کاپیاں/μL اور کم از کم سائیکل کی حد 15 منٹ ہے۔Suarez et al.[75] نے حال ہی میں LAMP کا استعمال کرتے ہوئے گرمی سے غیر فعال ناسوفرینجیل جھاڑو کے نمونوں میں SARS-CoV-2 RNA کی براہ راست پتہ لگانے کے لیے ایک مربوط ماڈیولر سینٹری فیوگل مائکرو فلائیڈک پلیٹ فارم کی ترقی کی اطلاع دی۔یہ مثالیں COVID-19 کی مالیکیولر تشخیص میں LOAD کے عظیم فوائد اور وعدے کو ظاہر کرتی ہیں۔
1945 میں مولر اور کلیگ [125] نے پہلی بار فلٹر پیپر اور پیرافین کا استعمال کرتے ہوئے کاغذ پر مائیکرو فلائیڈک چینلز پیش کیے۔2007 میں، Whitesides گروپ [126] نے پروٹین اور گلوکوز کی جانچ کے لیے پہلا فنکشنل پیپر پلیٹ فارم بنایا۔کاغذ مائکرو فلائیڈکس کے لیے ایک مثالی سبسٹریٹ بن گیا ہے۔کاغذ میں موروثی خصوصیات ہیں جیسے ہائیڈرو فیلیکٹی اور غیر محفوظ ساخت، بہترین بایو کمپیٹیبلٹی، ہلکا وزن، لچک، فولڈ ایبلٹی، کم قیمت، استعمال میں آسانی اور سہولت۔کلاسیکی µPADs کاغذی ذیلی جگہوں پر بنے ہوئے ہائیڈرو فیلک/ہائیڈروفوبک ڈھانچے پر مشتمل ہوتے ہیں۔سہ جہتی ساخت پر منحصر ہے، μPADs کو دو جہتی (2D) اور سہ جہتی (3D) μPADs میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔2D µPADs مائیکرو فلائیڈک چینلز بنانے کے لیے ہائیڈروفوبک باؤنڈریز بنا کر تیار کیے جاتے ہیں، جب کہ 3D µPADs عام طور پر 2D مائیکرو فلائیڈک کاغذ کی تہوں کے ڈھیر سے بنائے جاتے ہیں، بعض اوقات کاغذ کی تہہ بندی، سلپ تکنیک، کھلے چینلز اور 3D پرنٹنگ [96] کے ذریعے۔μPAD پر آبی یا حیاتیاتی سیال بنیادی طور پر کیپلیری فورس کے ذریعے بغیر کسی بیرونی طاقت کے منبع کے کنٹرول کیے جاتے ہیں، جو ری ایجنٹس کے پہلے سے ذخیرہ کرنے، نمونے سے نمٹنے، اور ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے میں سہولت فراہم کرتے ہیں۔تاہم، درست بہاؤ کنٹرول اور ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے میں ناکافی رفتار، حساسیت، اور دوبارہ استعمال کی وجہ سے رکاوٹ ہے [96, 127, 128, 129, 130]۔
ایک غیر معمولی مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم کے طور پر، HCV، HIV، اور SARS-CoV-2 [131, 132] جیسی متعدی بیماریوں کی سالماتی تشخیص کے لیے μPAD کو بڑے پیمانے پر فروغ اور ترقی دی گئی ہے۔HCV کی منتخب اور حساس شناخت کے لیے، Tengam et al.[133] فلوروسینٹ کاغذ پر مبنی ایک ناول بائیو سینسر تیار کیا جو پائرولیڈینیل پیپٹائڈ پر مبنی انتہائی مخصوص نیوکلک ایسڈ پروب کا استعمال کرتا ہے۔نیوکلک ایسڈز جزوی طور پر آکسائڈائزڈ سیلولوز پیپر پر امینو گروپس اور الڈیہائڈ گروپس کے درمیان تخفیف کندہ الکلیشن کے ذریعے ہم آہنگی سے متحرک ہوتے ہیں، اور پتہ لگانے کی بنیاد فلوروسینس پر ہوتی ہے۔ان سگنلز کو سیل فون کے کیمرے کے ساتھ مل کر پورٹیبل فلوروسینٹ کیمرہ کے ساتھ خصوصی طور پر بنائے گئے گیجٹ کے ذریعے پڑھا جا سکتا ہے۔اس کے بعد، Lu et al.[134] نے ڈی این اے ریڈوکس اشارے کے طور پر میتھیلین بلیو کا استعمال کرتے ہوئے ڈی این اے ہائبرڈائزیشن کے ذریعے ایچ آئی وی کے ہدف کا پتہ لگانے کے لیے نکل/گولڈ نینو پارٹیکلز/کاربن نانوٹوبس/پولی وینیل الکحل آرگنومیٹالک فریم ورک کمپوزٹ پر مبنی ایک کاغذ پر مبنی لچکدار الیکٹروڈ ڈیزائن کیا۔ابھی حال ہی میں، چودھری وغیرہ۔[135] نے LAMP اور پورٹ ایبل امیجنگ ٹیکنالوجی کے ساتھ مل کر خام مریض کے تھوک کا استعمال کرتے ہوئے پوائنٹ آف کیئر µPAD ٹیسٹنگ کے لیے ایک فرضی پلیٹ فارم ڈیزائن پیش کیا۔
پس منظر کے بہاؤ ٹیسٹ کیپلیری قوتوں کے ذریعہ سیالوں کی رہنمائی کرتے ہیں اور غیر محفوظ یا مائیکرو اسٹرکچرڈ سبسٹریٹس کی گیلا پن اور خصوصیات کے ذریعہ سیال کی نقل و حرکت کو کنٹرول کرتے ہیں۔پس منظر کے بہاؤ کے آلات نمونے، کنجوگیٹ، انکیوبیٹر اور پتہ لگانے، اور جاذب پیڈ پر مشتمل ہوتے ہیں۔ایل ایف اے میں نیوکلک ایسڈ کے مالیکیول مخصوص بائنڈرز کو پہچانتے ہیں جو بائنڈنگ سائٹ پر پہلے سے محفوظ ہوتے ہیں اور کمپلیکس کے طور پر جڑ جاتے ہیں۔جیسے ہی مائع انکیوبیشن اور ڈٹیکشن پلیٹوں سے گزرتا ہے، کمپلیکس ٹیسٹ اور کنٹرول لائنوں پر واقع کیپچر مالیکیولز کے ذریعے پکڑے جاتے ہیں، ایسے نتائج دکھاتے ہیں جنہیں براہ راست ننگی آنکھ میں پڑھا جا سکتا ہے۔عام طور پر، LFA 2-15 منٹ میں مکمل کیا جا سکتا ہے، جو روایتی دریافت سے زیادہ تیز ہے۔خصوصی طریقہ کار کی وجہ سے، LFA کو کچھ آپریشنز کی ضرورت ہوتی ہے اور اس کے لیے اضافی آلات کی ضرورت نہیں ہوتی، جو اسے بہت صارف دوست بناتا ہے۔اسے تیار کرنا اور چھوٹا کرنا آسان ہے، اور کاغذ پر مبنی سبسٹریٹس کی قیمت کم ہے۔تاہم، یہ صرف کوالٹیٹیو تجزیہ کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، اور مقداری پتہ لگانا بہت مشکل ہے، اور ملٹی پلیکسنگ کی صلاحیت اور تھرو پٹ بہت محدود ہے، اور ایک وقت میں صرف ایک کافی نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگایا جا سکتا ہے [96,110,127]۔
اگرچہ LFA کی زیادہ تر ایپلی کیشنز immunoassays پر مرکوز ہیں، مگر مائیکرو فلائیڈک چپس میں سالماتی تشخیص کے لیے LFA کا استعمال بھی موثر اور مقبول ہے [136]۔ہیپاٹائٹس بی وائرس کی صورت میں، HIV اور SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] نے ایک اپ کنورژن نینو پارٹیکل ایل ایف اے پلیٹ فارم کی تجویز پیش کی اور HBV نیوکلک ایسڈ جیسے متعدد اہداف کی حساس اور مقداری کھوج کے ذریعے اس چھوٹے اور پورٹیبل پلیٹ فارم کی استعداد کا مظاہرہ کیا۔اس کے علاوہ، Fu et al.[138] نے کم ارتکاز میں HIV-1 DNA کے مقداری تجزیہ کے لیے سطح سے بہتر رمن سپیکٹروسکوپی پر مبنی ایک ناول LFA کا مظاہرہ کیا۔SARS-CoV-2 کی تیز اور حساس شناخت کے لیے، Liu et al.[85] نے RT-RPA اور یونیورسل لیٹرل فلو ڈٹیکشن سسٹم کو ایک واحد مائکرو فلائیڈک سسٹم میں ملا کر مائکرو فلائیڈک-انٹیگریٹڈ RPA لیٹرل فلو تجزیہ تیار کیا۔
مختلف مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارمز کا اطلاق مخصوص مطالعات کے لحاظ سے مختلف ہوتا ہے، پلیٹ فارم کی صلاحیتوں اور فوائد کا پورا فائدہ اٹھاتے ہوئے۔سستی والوز، پمپس اور ڈکٹ کے ساتھ، LOCC ایپلیکیشن کے تنوع اور انٹرآپریبلٹی کے لیے سب سے زیادہ جامع پلیٹ فارم ہے جس میں ترقی کے لیے بہترین گنجائش ہے۔لہذا، ہم امید کرتے ہیں اور تجویز کرتے ہیں کہ LOCC میں پہلی کوشش کے طور پر جدید ترین مطالعات کی جائیں اور حالات کو بہتر بنایا جائے۔اس کے علاوہ، نظام میں مزید موثر اور درست طریقے دریافت اور استعمال کیے جانے کی توقع ہے۔LOAD موجودہ LOCC ڈیوائسز سے مائعات کے عین مطابق کنٹرول میں کمال رکھتا ہے اور بیرونی ڈرائیوز کی ضرورت کے بغیر سینٹرفیوگل فورس کے ذریعے سنگل ڈرائیوز میں منفرد فوائد کا مظاہرہ کرتا ہے، جبکہ متوازی ردعمل کو الگ اور ہم آہنگ کیا جا سکتا ہے۔اس طرح، مستقبل میں، LOAD کم دستی آپریشنز اور زیادہ پختہ اور خودکار ٹیکنالوجیز کے ساتھ مرکزی مائیکرو فلائیڈک پلیٹ فارم بن جائے گا۔µPAD پلیٹ فارم کم قیمت، واحد استعمال کی تشخیص کے لیے LOCC اور کاغذ پر مبنی مواد کے فوائد کو یکجا کرتا ہے۔لہذا، مستقبل کی ترقی کو آسان اور اچھی طرح سے قائم ٹیکنالوجی پر توجہ مرکوز کرنا چاہئے.اس کے علاوہ، ایل ایف اے ننگی آنکھوں کی کھوج کے لیے موزوں ہے، جو نمونے کی کھپت کو کم کرنے اور پتہ لگانے میں تیزی لانے کا وعدہ کرتا ہے۔پلیٹ فارم کا تفصیلی موازنہ جدول 2 میں دکھایا گیا ہے۔
ڈیجیٹل تجزیہ نمونے کو کئی مائیکرو ری ایکٹرز میں تقسیم کرتا ہے، جن میں سے ہر ایک ہدف کے مالیکیولز کی مجرد تعداد پر مشتمل ہوتا ہے [139، 140]۔ڈیجیٹل اسسز مسلسل مرحلے کے بجائے مائکرون اسکیل کمپارٹمنٹس میں بیک وقت اور انفرادی طور پر ہزاروں متوازی بائیو کیمیکل تجربات کرکے مطلق مقدار کا تعین کرنے کے لیے اہم فوائد پیش کرتے ہیں۔روایتی مائیکرو فلائیڈکس کے مقابلے میں، کمپارٹمنٹ ری ایکشنز نمونے کے حجم کو کم کر سکتے ہیں، رد عمل کی کارکردگی کو بڑھا سکتے ہیں، اور چینلز، پمپ، والوز، اور کمپیکٹ ڈیزائن کی ضرورت کے بغیر دوسرے تجزیاتی طریقوں کے ساتھ آسانی سے مربوط ہو سکتے ہیں [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147]۔حل کی یکساں اور درست علیحدگی کو حاصل کرنے کے لیے درج ذیل دو طریقے ڈیجیٹل اسیس میں استعمال کیے جاتے ہیں، بشمول ری ایجنٹس اور نمونے جیسے کہ خلیات، نیوکلک ایسڈ، اور دیگر ذرات یا مالیکیول: (1) مائع انٹرفیس کی عدم استحکام کا استحصال کرنے والے ایمولشنز چھوڑتے ہیں۔(2) سرنی کی تقسیم آلہ کی ہندسی رکاوٹوں کے ذریعہ کی جاتی ہے۔پہلے طریقہ میں، مائیکرو چینلز میں ری ایجنٹس اور نمونوں پر مشتمل بوندوں کو غیر فعال طریقوں سے بنایا جا سکتا ہے جیسے کو-کرنٹ، کراس فلو، فلو فوکسنگ، اسٹیجڈ ایملسیفیکیشن، مائیکرو چینل ایملسیفیکیشن، اور جھلیوں کے ذریعے چپکنے والی قینچ والی قوتوں اور چینل کی تبدیلی کے ساتھ ایملسیفیکیشن۔لوکلائزیشن [143، 145، 146، 148، 149] یا فعال طریقے استعمال کرتے ہوئے [150، 151]، جو بجلی، مقناطیسی، تھرمل اور مکینیکل کنٹرول کے ذریعے اضافی توانائی متعارف کراتے ہیں۔مؤخر الذکر نقطہ نظر میں، مائیکرو فلائیڈک چیمبرز میں سیال کے حجم کی بہترین یکسانیت کو ایک ہی سائز کے مقامی ڈھانچے، جیسے مائیکروپٹس اور سطحی صفوں [152,153,154] کو رکھ کر شیئر کیا جاتا ہے۔خاص طور پر، بوندیں بڑے بہاؤ والے حصے ہیں جو ڈیجیٹل مائیکرو فلائیڈکس (DMF) کی بنیاد پر الیکٹروڈ اریوں پر بھی تیار اور ہیرا پھیری کی جا سکتی ہیں۔ڈائی الیکٹرکس کی الیکٹروویٹنگ ایک بہترین مطالعہ شدہ DMF تھیوریوں میں سے ایک ہے، کیونکہ ڈائی الیکٹرکس کی الیکٹرویٹٹنگ انفرادی قطروں کے عین مطابق ہیرا پھیری کی اجازت دیتی ہے، مختلف اطراف سے گزرنے والے مائع اور غیر متناسب برقی سگنل کی شکل کو کنٹرول کرتی ہے [141, 144]۔ڈی ایم ایف میں بوندوں کے ساتھ اہم کارروائیوں میں چھانٹنا، تقسیم کرنا، اور انضمام [151, 155, 156] شامل ہیں، جن کا اطلاق تجزیہ کے مختلف شعبوں میں کیا جا سکتا ہے، خاص طور پر سالماتی پتہ لگانے میں [157، 158، 159]۔
ڈیجیٹل نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانا روایتی PCR اور مقداری ریئل ٹائم PCR (qPCR) کے بعد ایک تیسری نسل کی مالیکیولر تشخیصی ٹیکنالوجی ہے، جس کے متوازی طور پر ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ اور مائع بایپسی ہے۔پچھلی دو دہائیوں میں، متعدی پیتھوجینز [160, 161, 162] کی مالیکیولر تشخیص کے میدان میں ڈیجیٹل نیوکلک ایسڈز نے تیزی سے ترقی کی ہے۔ڈیجیٹل نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کی مکمل مقدار کا آغاز نمونوں اور ریجنٹس کو انفرادی کمپارٹمنٹ میں پیک کرنے کے ساتھ ہوتا ہے تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ ہر ہدف کی ترتیب میں ہر انفرادی کمپارٹمنٹ میں داخل ہونے کا یکساں امکان ہے۔نظریاتی طور پر، ہر سیکشن کو متعدد ہدف کے سلسلے تفویض کیے جا سکتے ہیں، یا ہو سکتا ہے کہ کوئی آزاد مائیکرو ری ایکشن سسٹم نہ ہو۔اوپر بیان کیے گئے مختلف سینسنگ میکانزم کے ذریعے، مائکروبیل ٹارگٹ سیکیونس والے کمپارٹمنٹس جو ایک مخصوص حد سے اوپر سگنلز پیدا کرتے ہیں ان کو ننگی آنکھ سے یا مشین کے ذریعے دیکھا جا سکتا ہے اور ان پر مثبت کا لیبل لگایا جاتا ہے، جب کہ دوسرے کمپارٹمنٹ جو دہلیز سے نیچے سگنلز پیدا کرتے ہیں ان پر مثبت لیبل لگایا جاتا ہے۔ .منفی، جو ہر سیکشن کے لیے بولین سگنل بناتے ہیں۔اس طرح، بنائے گئے کمپارٹمنٹس کی تعداد اور رد عمل کے بعد مثبت نتائج کی شرح کا حساب لگا کر، ٹیسٹ کے نمونوں کی اصل کاپیوں کو معیاری وکر کی ضرورت کے بغیر پوسن ڈسٹری بیوشن فارمولے کا استعمال کرتے ہوئے ملایا جا سکتا ہے، جو معمول کے مقداری تجزیوں کے لیے ضروری ہوتا ہے۔ کیو پی سی آر کے طور پر۔[163] روایتی مالیکیولر تشخیصی طریقوں کے مقابلے میں، ڈیجیٹل نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے میں اعلی درجے کی آٹومیشن، اعلی تجزیہ کی رفتار اور حساسیت، کم ری ایجنٹس، کم آلودگی، اور آسان ڈیزائن اور تیاری ہوتی ہے۔ان وجوہات کی بناء پر، SARS-CoV-2 کے شدید پھیلنے کے دوران، مالیکیولر تشخیص کے لیے ڈیجیٹل اسیسز، خاص طور پر ڈراپ پر مبنی طریقوں کا استعمال، ایمپلیفیکیشن اور سگنل ریڈ آؤٹ تکنیکوں کا اچھی طرح مطالعہ کیا گیا ہے۔مثال کے طور پر، Yin et al.مائیکرو فلائیڈک چپ میں SARS-CoV-2 میں ORF1ab, N، اور RNase P جینوں کا پتہ لگانے کے لیے مشترکہ قطرہ نما ڈیجیٹل اور تیز پی سی آر طریقے۔خاص طور پر، سسٹم 115 سیکنڈ کے اندر ایک مثبت سگنل کی شناخت کرنے میں کامیاب رہا، جو روایتی پی سی آر سے تیز ہے، جو پوائنٹ آف کیئر کا پتہ لگانے میں اس کی تاثیر کو ظاہر کرتا ہے (شکل 7a)۔ڈونگ وغیرہ۔[165]، بونا وغیرہ۔[157]، چن وغیرہ۔[166] اور الٹیری وغیرہ۔SARS-CoV-2 کا پتہ لگانے کے لیے ڈراپلیٹ ڈیجیٹل پی سی آر (ddPCR) کو بھی متاثر کن نتائج کے ساتھ مائکرو فلائیڈک سسٹم میں لاگو کیا۔پتہ لگانے کی شرح کو مزید بہتر بنانے کے لیے، Shen et al.[168] نے تصویر سلائی کی تکنیک کے استعمال کے بغیر ddPCR پر مبنی چپ امیجنگ 15 سیکنڈ میں حاصل کی، ddPCR ٹیکنالوجی کے عمل کو لیب سے اپلیکیشن تک تیز کر دیا۔نہ صرف تھرمل ایمپلیفیکیشن کے طریقے جیسے کہ پی سی آر کو لاگو کیا جاتا ہے، بلکہ رد عمل کے حالات اور تیز ردعمل کو آسان بنانے کے لیے آئسوتھرمل ایمپلیفیکیشن کے طریقے بھی استعمال کیے جاتے ہیں۔لو وغیرہ۔[71] نے بوندوں کے تجزیہ کے لیے SlipChip تیار کی، جو ایک قدم میں اعلی کثافت پر مختلف سائز کی بوندیں پیدا کرنے اور ڈیجیٹل LAMP (شکل 7b) کا استعمال کرتے ہوئے SARS-CoV-2 نیوکلک ایسڈ کی مقدار درست کرنے کی صلاحیت رکھتی ہے۔ایک تیزی سے ترقی کرتی ہوئی ٹیکنالوجی کے طور پر، CRISPR اضافی نیوکلک ایسڈ داغوں کی ضرورت کے بغیر آسان رنگین امیجنگ کے ذریعے ڈیجیٹل نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے میں بھی اہم کردار ادا کر سکتا ہے۔Ackerman et al.نیوکلک ایسڈز کی ملٹی پلیکس تشخیص کے لیے ایک مشترکہ میٹرکس رد عمل تیار کیا۔[158] نے مائیکرو ویل پرکھ (شکل 7c) میں CRISPR-Cas13 پر مبنی نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے والے ریجنٹس پر مشتمل بوندوں میں SARS-CoV-2 سمیت 169 انسانوں سے وابستہ وائرسوں کا پتہ لگایا۔اس کے علاوہ، دونوں کے فوائد کو یکجا کرنے کے لیے ایک ہی نظام میں isothermal amplification اور CRISPR ٹیکنالوجی کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔پارک وغیرہ۔ایک CRISPR/Cas12a ڈیجیٹل پرکھ ایک کمرشل مائیکرو فلائیڈک چپ میں تیار کی گئی تھی تاکہ نکالے گئے اور گرمی سے مارے جانے والے SARS-CoV-2 کا پتہ لگانے کے لیے سنگل اسٹیج RT-RPA کی بنیاد پر مختصر اور زیادہ سگنل سے پس منظر کا پتہ لگایا جا سکے۔ وقت کا تناسب، وسیع تر متحرک رینج اور بہتر حساسیت (تصویر 7 ڈی)۔ان مثالوں کی کچھ وضاحتیں جدول 3 میں دی گئی ہیں۔
نیوکلک ایسڈ کا پتہ لگانے کے لیے عام ڈیجیٹل پلیٹ فارم۔تیز رفتار ڈیجیٹل پی سی آر ورک فلو چار اہم مراحل پر مشتمل ہے: نمونے کی تیاری، رد عمل کے مرکب کی تقسیم، ایمپلیفیکیشن کا عمل، اور ہدف کی مقدار کا تعین ([164] سے اخذ کردہ)۔b اعلی کثافت پر بوندوں کی تشکیل کے لئے SlipChip بوندوں کا اسکیمیٹک تجزیہ ([71] سے موافقت)۔c CARMEN-Cas ورک فلو ڈایاگرام13 ([158] سے اخذ کردہ)۔d ایک برتن میں CRISPR/Cas کے ساتھ جدید ڈیجیٹل وائرس کا پتہ لگانے کا جائزہ ([169] سے اخذ کیا گیا)۔W/O واٹر ان آئل، پولیڈیمیتھائلسلوکسین PDMS، PCR پولیمریز چین ری ایکشن، DAQ ڈیٹا اکٹھا کرنا، PID متناسب انٹیگرل ڈیریویٹیو، ملٹی پلیکس نیوکلک ایسڈ کی تشخیص کے لیے کارمین کمبینیٹریل میٹرکس ری ایکشن، SARS-CoV-2، شدید ایکیوٹ ریسپائریٹری سنڈروم، کورونا وائرس پس منظر میں ریورس ٹرانسکرپٹیس ریکومبینیز پولیمریز-RPA، S/B سگنل کا RT ایمپلیفیکیشن